甲醇中毒大鼠视网膜及肝脏细胞的超微结构改变

吕海辰，齐曾鑫，傅晓键，蔡加彬，沈奇伟，朴丰源

(1.复旦大学上海医学院 8年制临床医学，上海 200032；2.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁，大连，116044)

甲醇(Methanol, CH3OH)，是结构最简单的饱和一元醇，又称“木醇”或“木精”，是一种无色、有毒的挥发性酒精气味液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收入血，进而导致中毒，是假酒的主要致毒物质。近年因饮入假酒致甲醇中毒的病例常发生，患者急性期主要表现为肝脏损伤，愈后常遗留不同程度的视力障碍[1-3]。有关甲醇中毒的研究并不少见，但多仅限于临床病例报道[4-5]，而对甲醇引起的肝细胞和视网膜细胞形态学，特别是超微结构变化的中毒病理学研究报道尚少。本研究选用SD大鼠，用甲醇和乙醇的不同比例混合液模拟假酒灌胃，建立假酒中毒动物模型，观察甲醇中毒引起的肝细胞和视网膜细胞的超微结构变化，探讨甲醇所致肝脏功能障碍和视力损害的超微结构形态学基础，为有效治疗甲醇中毒提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

健康雄性SD大鼠16只，用随机数排序法分为4组,每组4只。即甲醇组，被给于25%甲醇蒸馏水；甲醇、乙醇混合组，被给于25%甲醇生理盐水与25%乙醇蒸馏水等量混合液；乙醇组，被给于25%乙醇蒸馏水；对照组，被给于蒸馏水。将首次灌胃的时间被定为0 h，分别在灌胃后的第10 h、24 h、48 h对各组大鼠再进行灌胃。甲醇组：首次甲醇灌胃剂量为2 g/kg，其后每次1 g/kg；甲醇、乙醇混合组：以甲醇计量，首次剂量1 g/kg，其后每次0.5 g/kg；乙醇组：乙醇灌胃剂量为2 g/kg，其后每次1 g/kg；对照组：与实验组等剂量蒸馏水灌胃，首次氯化钠剂量为8 g/kg，其后每次4 g/kg。在进行实验前先行预实验来熟练技术方法和确定试药剂量，以尽可能减小实验技术造成的组间误差。

1.2 评价指标及实验方法

1.2.1 动物模型建立：以大鼠对光刺激的反应速度作为评价模型是否成功建立的依据。正常大鼠对迎面光照刺激反应敏感且迅速，而染毒大鼠对同样光刺激的反应迟钝甚至消失。

1.2.2 全身及眼、肝脏中毒表现：通过观察和记录药物灌胃后大鼠的反应速度、活动、意识状态及对光刺激的反应变化确定大鼠是否中毒。

1.2.3 染毒大鼠肝细胞和视网膜细胞的超微结构观察：灌胃48 h 脱臼法处死大鼠，迅速摘除肝脏及双侧眼球，分离切取1 mm×5 mm大小肝和视网膜组织，PBS冲洗后2.5%戊二醛固定，4 ℃冰箱过夜。次日，1%四氧化锇后固定2 h，丙酮系列脱水，定向包埋，半薄切片显微镜下定位，并制成超薄切片。以醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染法染色，透射电镜下观察肝细胞和视网膜细胞的超微结构变化。

2 结 果

2.1 中毒表现

对照组动物毛色光亮，反应如常，眼、鼻处肉眼观均无异常。与对照组相比，甲醇组动物毛色灰暗，活动减少，反应呆滞，对光刺激的反应明显减弱，结膜出血、鼻孔出血，并伴有运动失调；甲醇、乙醇混合组动物毛逆、成团、欠规则，反应迟钝，对光刺激无强烈反应，结膜充血，鼻孔出血，运动不灵活。上述两实验组大鼠的异常变化在第1次灌胃后开始出现，且随灌胃次数增加不断加重，且相邻两次灌胃之间症状不缓解。乙醇组动物毛色一般，反应迟钝，对光刺激反应较弱，眼部结膜无明显充血或出血，鼻孔无出血，每次灌胃后上述反应加重，但在相邻两次灌胃之间症状缓解。实验结束时，甲醇组及甲醇、乙醇混合组动物的体质明显减弱，而乙醇组动物则略虚弱于对照组。

2.2 电镜下病理变化

2.2.1 肝组织的改变：对照组动物肝细胞线粒体排列有序，大小一致，多数呈球形，电子密度较大，可见嵴结构；粗面内质网排列整齐、核糖体颗粒丰富(图1a)。与对照组相比，乙醇组动物肝细胞线粒体体积大小不等，形态略不规则，电子密度明显降低，部分基质溶解、部分嵴结构消失；内质网数量减少，并扩张、膨胀、膜融合，核糖体脱落并与病态内质网混合于胞质中(图1b)。甲醇组动物肝细胞线粒体的形状不规则和大小不等，电子密度降低，双层膜和嵴结构均模糊不清；粗面内质网数量减少、并有脱颗粒现象，高度囊性变与少量核糖体颗粒混溶形成胞质的溶解区(图1c)；甲醇、乙醇混合组动物线粒体极度肿胀、几呈空泡状，大小、形状没有规则，双层膜结构几乎消失，电子密度很低，绝大多数粗面内质网消失与极少量核糖体混合为形状及分布均不规则的大片溶解区(图1d)。

2.2.2 视网膜组织(视锥视杆层细胞外节膜盘)的改变：对照组大鼠视网膜外核层感光细胞外节内膜盘(即光感受器)呈规则、有序板层排列，膜盘界限分明(图2a)；乙醇组动物视网膜膜盘结构仍清晰、规则，部分区域排列略疏松，磨盘之间分界明显(图2b)；甲醇组动物视网膜膜盘感光细胞排列不规则，膜盘间缝隙增大,并失去正常板层结构，同时可见空泡样改变，局部出现膜盘溶解、相互融合、分辨不清(图2c)；甲醇、乙醇混合组动物视网膜外节膜盘排列无规则，膜盘缝隙明显增大，有明显的空泡样改变，局部区域膜盘彻底失去板层样结构而呈紊乱排列的髓样结构，磨盘失去界限，相互融合(图2d)。

图1 各组大鼠肝细胞胞质局部超微结构 ×6500Fig 1 Cytoplasm ultrastructure of liver cells in each group ×6500

图2 各组大鼠视网膜视锥视杆层膜盘超微结构 ×6500Fig 2 Ultrastructure of retinal cone-rod layer membrane discs in each group ×6500

3 讨 论

人类急、慢性甲醇中毒的主要临床表现为肝脏功能的衰竭、眼部的损害和神经系统的损伤。临床上，以甲醇摄入史、血液甲醇浓度异常、肝脏、眼部和神经系统损害的症状为诊断依据；体征如头痛、意识功能障碍、感觉障碍、视物不清、视野缩小、视网膜电图和视觉诱发电位异常等[4-5]。本实验主要采用灌胃的方式模拟甲醇经口进入的过程，建立了大鼠甲醇中毒动物模型，并借鉴临床对患者观察和诊断的一些方法，观察了染毒动物的体表和行为变化。发现动物模型中大鼠染毒后的出现的体表改变和行为变化与甲醇中毒患者相似，提示大鼠已发生了甲醇中毒。

电镜下，甲醇染毒或甲、乙醇混合染毒大鼠肝细胞的线粒体肿胀，双层膜的原有结构发生模糊，同时有粗面内质网的退化、扩张、溶解、脱颗粒等。肝脏是人体物质代谢的重要器官，其解毒、合成作用强大，且不可或缺[6]。肝脏功能的完成依赖于完整的细胞内膜系统的存在，内质网在其中起到了重要作用。因而甲醇对内质网的破坏作用必然影响肝脏的解毒过程以及各种物质的合成；线粒体的损害则影响到了肝组织的能量供应，必然会使肝组织的代谢水平显著下降。值得注意的是，同时染毒甲醇和乙醇动物的肝细胞的上述损害更为显著。假酒多由甲醇与乙醇勾兑而成，其对人体肝脏的伤害可能重于单一甲醇。

甲醇对眼部损害主要体现在眼底的异常改变和结膜充血或出血。本实验发现甲醇对感光细胞的光感受器(膜盘)有明显的损伤作用。这种损伤使光刺激传递通路从初始点就出现了功能障碍，严重影响视网膜视觉信号传导产生[7]，这可能是甲醇中毒引起视觉障碍的原因之一。

视网膜各层，尤其是光感受器内的生化代谢极为活跃，是体内耗氧量较高的器官之一，而线粒体则是细胞内提供能量的主要装置。若线粒体电子传递及氧化磷酸化受阻，将导致细胞离子泵功能障碍，各层组织以及细胞器的水肿和病态膨胀，从而影响细胞功能。甲醇对视力的损伤可能与其对线粒体的损伤作用有关。

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