Duffy血型研究及临床应用新进展

苏宇清，梁延连，张印则，宋 骋

(深圳市血液中心,广东 深圳 518035)

Duffy血型研究及临床应用新进展

苏宇清，梁延连，张印则，宋 骋

(深圳市血液中心,广东 深圳 518035)

Duffy血型是人类最重要的血型系统之一，Duffy血型不仅仅与输血安全及母婴血型不合引起的新生儿溶血病密切相关，Duffy抗原作为趋化因子还在人类疟疾疟原虫受体、炎症、肿瘤、移植排斥等方面发挥着重要作用。本文从Duffy抗原表达和基因结构、Duffy血型在人群中的分布、Duffy血型的检测方法、Duffy血型生物学功能及临床应用等方面，综述国内外关于Duffy血型研究与临床应用的现状及最新进展。

Duffy血型；基因多态性；表现频率；临床应用

Duffy血型是于1950年，在一名因多次输血导致溶血反应的患者血清中，由Cusbush等人发现抗Fya抗体，由于该患者姓Duffy，故称该血型为Duffy血型。一年后,Ikin等发现了与Fya抗原相对应的Fyb抗原。1995年，国际输血协会(ISBT)将Duffy血型系统编号为008[1]。近年来，随着社会科技的不断发展，红细胞Duffy血型检测因其在临床应用中的重要意义而倍受关注，最新研究表明，Duffy血型不仅仅与输血安全及母婴血型不合引起的新生儿溶血病相关，Duffy抗原作为趋化因子还在人类疟疾疟原虫受体、炎症、肿瘤、移植排斥等方面发挥着重要作用。本文就Duffy血型血清学、基因、功能检测以及临床应用等方面的研究进行综述。

1 Duffy抗原表达和基因结构

Duffy血型系统共有6个抗原，即Fya(001)，Fyb(002)，Fy3(003)，Fy4(004)，Fy5(005)和 Fy6(006)， 其中最重要的是Fya与Fyb抗原。Fya与Fyb抗原都是在胎儿出生时就已经完全发育，并且在胎儿很小时的红细胞上Fya及Fyb抗原就已和成人红细胞上的表达一样强了[2]。Duffy抗原不仅能在红细胞上表达，而且均能在全身毛细血管后微静脉内皮细胞以及小脑浦肯野细胞表面等发现，就算是阴性个体Fy(a-b-)在骨髓中检测不到Duffy的mRNA也能表达于脑、肝脏以及肠等器官上[3]。

Duffy血型抗原是位于细胞膜表面的糖蛋白，分子质量为35000～50000，是一种趋化因子受体[4](Duffy Antigen Receptor for Chemokines,DARC)，其成熟蛋白是α螺旋7次跨膜，N端在细胞外，C端在细胞内[5]，属于G蛋白偶联家族。Fya和Fyb对多数蛋白水解酶敏感，经木瓜蛋白酶、无花果酶、菠萝酶、链霉蛋白酶和胰蛋白酶处理的红细胞能够完全破坏Fya和Fyb抗原，而胰岛素不能破坏Fya和Fyb的活性[6]，唾液酸酶处理的红细胞对Duffy抗原没有任何影响[7]。

Chaudhuri等[8]首次克隆了FY cDNA,而后人们进一步证明了编码Duffy血型的基因位于常染色体1q22-q23，具有2个外显子，且被1个479bp的内含子分隔，编码336个或338个氨基酸，形成3个主要等位基因FYA、FYB和FY(沉默基因)。其中FYA与FYB等位基因分别编码Fya和Fyb抗原，它们区别为cDNA第125个核苷酸是否有单碱基G变A，致使氨基酸第42位上的编码产物Gly变Asp[9]，从而产生了多态性FYA和FYB，而且还在FYA序列中产生了一个BanI酶切位点。另一个等位基因FY为沉默基因，决定Duffy阴性表现型Fy(ab-)，Fy(a-b-)红细胞上缺乏Duffy的糖蛋白，FY的编码序列与FYB的等位基因基本相同，其区别在于基因启动区里有一个突变T33C，这一突变正好位于GATA序列上，即CTTATCT到CTTACCT，这使得红系GATA1转移因子的结合被破坏，使该基因在红细胞上表达受阻[10]，但这不影响它在其他细胞上的表达。

2 Duffy血型在人群中的分布

除了人体骨髓中，在肺、肌肉、脾、结肠、心脏、胰腺、肾脏和脑中均能检测到Duffy mRNA。使用抗Fya和抗Fyb抗血清检测人类红细胞，能将Duffy血型的表现型分为 Fy(a+b-)、Fy(a+b+)、Fy(a-b+)、Fy(a-b-)。Duffy血型表现型在不同人种中分布有很大区别如表1[11]所示，Fy(a-b+)血型在欧洲人及非洲人种中的表现频率显著高于亚洲日本人，而Fy(a-b-)表现型是沉默基因FY的纯合子的产物，在美洲黑人和非洲黑人，其FYA及FYB频率有区别，但是其FY沉默基因的频率与欧洲人比则要高，非洲黑人Fy(a-b-)表现型达90%以上，然而Fy(a-b-)血型在白种人和其它人种中非常罕见。而中国人的Fya的表现频率为99%，Fyb则为9.2%[12]，综合国内报道表现频率和基因频率如表2所示，其中华北汉族人群Fy(a-b+)和Fy(a-b-)表现型的频率显著高于中国其他地区。

表1 欧洲人、非洲人及亚洲日本人Duffy血型表现频率

表2 中国部分地区Duffy分布表现型频率及基因频率

3 Duffy血型的检测方法

目前，Duffy血型的检测方法有很多，如血清学表型检测、基因检测及功能检测等。Fya和Fyb抗原数量分别为 13000～14000，Fya和Fyb对多数蛋白水解酶敏感，经木瓜蛋白酶、无花果酶、菠萝酶等处理的红细胞能完全破坏其Fya和Fyb抗原，因此不能使用酶法检测Duffy血型抗原，而是利用相应血清抗体做间接抗球蛋白及其它促凝介质实验来加以鉴定。此外，利用 Fya、Fyb、Fy6、Fy3 单克隆抗体对其相应的Duffy血型抗原做流式细胞仪分析,估算红细胞上Duffy抗原位点数[13]。也可以通过红细胞膜分离的糖蛋白进行免疫印迹法检测Duffy抗原数量的变化[14]。国内外建立了一种酶联免疫竞争法来检测Duffy抗原活性、病中变化规律及临床意义用以研究DARC蛋白作为趋化因子受体的生物学功能。

通过对Duffy血型基因结构，FYA、FYB及FY等位基因碱基变化的了解，设计了以PCR为基础的分子生物学技术用以判断其基因型。常用的基因检测方法是PCR-SSP，可以利用4条特异性引物来对Duffy基因定型，即2条分别针对C-33(FY)或T-33(FYA或FYB)正向引物和2条反向引物G125(FYA)或A125(FY或FYB)，它们中任意组合，而当FY、FYA和FYB任何一个存在时则其扩增产物约为700bp。

G125A的替代在造成FYA和FYB的多态性的同时，也在FYA等位基因中产生一个BanI酶切位点，而在FY和FYAB的多态性T-33C替代中，也使FY等位基因产生一个StyI酶切位点。结合两种多态性位点，使用PCR-RFLP法,用相应的限制性内切酶对PCR扩增片段进行消化，根据消化后的片段长度可判断基因型。

Duffy血型基因型的PCR-SSP法虽然简单，但由于FYA和FYB等位基因特异性引物只相差1个碱基，因此特异性扩增产物易出现假阳性[15]。PCR-RFLP法检测Duffy血型基因也同样存在这些问题,且难以同时检出FYA、FYB及FY基因型.解决以上问题的最佳方法是通过建立Duffy血型基因的DNA基因测序技术，通过对做Duffy基因编码区域及基因启动区域序列进行测序,可以准确了解Duffy血型基因结构，为Duffy血型的分子生物学研究提供了更精准的技术平台。

4 Duffy血型生物学功能及临床应用

Duffy血型在临床安全输血中具有重要的意义，Duffy血型抗体可以由多次妊娠引起，但大多数是由于输血而产生，也曾报道发生2例 “天然产生”的抗Fyb[16]。欧洲人中抗-Fyb是一个相对稀有的抗体，它的抗体产生频率通常是抗Fya的1/20。中国人中抗-Fya抗体的产生相对罕见，陈忠，张莉尼[17]曾报道121份溶血性输血反应不规则抗体，只有1例抗-Fya。与输血反应密切相关的Duffy抗原有Fya及Fyb，抗-Fya与抗-Fyb能引起速发型或迟发型溶血性输血反应，虽然大多数只是轻微的反应，但一些急性反应仍是致命的，所以如若检查到了其相应抗体则必须输阴性血液[18]。Duffy血型抗体还可以引起新生儿溶血病，一般症状比较轻，偶尔也非常严重，需进行光疗法及宫内输血。Duffy抗原不易保存，就算是冷冻抗原也会减弱，只能用特殊抗凝剂保存，故常需要利用Duffy基因定型来筛选与之相符的表现型的血液。

引起人类疟疾的疟原虫以间日疟原虫和恶性疟原虫最为常见。Duffy血型抗原是间日疟原虫的受体[19]。在几十年以前人们就知道了大多的黑人都不会感染间日疟原虫，而黑人大多数都是表现型为Fy(a-b-)。Miller等首次报道了当表型为Fy(ab-)时可不受间日疟感染[20]。让11名黑种人和6名白种人志愿者有感染间日疟原虫的机会，只有表现型是Fy(a-b-)的5名黑种人未感染疟疾，其他的人都被感染了，在有247人都是表现型为Fy(a-b-)的420名洪都拉斯人中，有14人受间日疟原虫的感染，但受感染的人的表现型都不是Fy(a-b-)。

最新研究表明，Duffy抗原还是红细胞趋化因子，命名为Duffy抗原/趋化因子受体(Duffy antigen/receptor for chemokine,DARC)。通过超微结构分析发现间日疟原虫与Duffy抗原阳性红细胞的对接区双脂质层下有一电子密度结构 (牢固结合点),间日疟原虫能于此处与DARC紧密结合从而入侵红细胞，这种结构对于其入侵红细胞很有必要，由于Fy(a-b-)型的个体缺乏DARC，从而能抵抗疟原虫裂殖子的入侵。Singh等[21]设计了一种可以使得大肠埃希菌表达一个Duffy蛋白功能区域，该区域能与间日疟原虫结合。

Duffy抗原作为趋化因子受体，能与多种前炎症趋化因子结合，趋化因子趋动细胞因子参与多项细胞事件，特别是白细胞活化和募集[22]。Duffy抗原的DARC蛋白是一种清除受体，其主要是能清除血循环中的趋化因子[23]。而许多的趋化因子含量在炎症的发生、发展及转化中具有很大的影响。因此，DARC能参与到炎症的调节中。无论是Duffy阳性的人还是非洲的Fy(a-b-)的人，Duffy糖蛋白在体内许多的细胞上都有表达。在被感染了HIV肾病的小孩的肾脏组织里，人们检测出了Duffy糖蛋白存在适度的上调，则可能是由于Duffy糖蛋白在肾炎里有一定作用[24]。

Duffy抗原与肿瘤的生长、浸润、转移和许多事件相关，而趋化因子及其受体也在这些事件中起到作用[25]。肿瘤的转移为具有高度组织性的非随机性及器官选择性的多步骤过程。表达Duffy抗原可以抑制肿瘤的成瘤性和转移。例如，Duffy抗原/趋化因子对于乳腺癌是一个负性调控因子，其清除促血管性趋化因子的作用对于抑制肿瘤的进展是很重要的，通过Woolley[26]等应用流式细胞的方法检测红细胞表面的Duffy抗原的数量以及Horuk[27]等研究的红白血病细胞，显示可以通过红细胞清除很多成瘤性的趋化因子，从而降低乳腺癌细胞的趋化运动，削弱癌转移的能力,国内有研究表明Duffy表型多态性与乳腺癌的关系，Fy（a-）表型对于发现潜在的腋淋巴结转移的乳腺癌患者有帮助[28]。

Duffy抗原与移植排斥的相关性，Akalin E等[29]研究163名非裔美国人肾移植患者的Duffy抗原状态发现，与白人相比，非裔美国人发生急性移植排斥反应的比例较高而移植存活率较低，Duffy各表型之间的差异无显著性，但Fy(a-b-)患者移植物衰竭与延迟排斥反应高度相关，说明DARC可作为趋化因子清除槽减低延迟排斥反应(DGF)过程中的炎症反应，而DARC阴性患者表型为DGF易损伤。

美国Loma Linda大学的Subburaman Mohan博士及其同事在《基因组研究》(Genome Res，2007)中报告，Duffy抗原基因多态性似乎可引起骨矿密度变化，并可能影响个体骨质疏松症风险。

从最初发现了Duffy抗原与临床输血安全及新生儿溶血病之间的关系，到证明其抗原是人类疟原虫受体及杂性趋化因子受体，随着对Duffy血型的不断研究，我们对Duffy抗原的功能以及分子结构有了更深入的了解，对于相关疾病的诊断、治疗及预防具有重要的指导作用。

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R457.1+1

A

1674-1129(2012)05-0452-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.011

苏宇清，女，1968年10月出生，主任技师，专业：输血医学