南方汉族急性髓细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的研究

何柳媚，甄建新，徐筠娉，邓志辉

(深圳市血液中心，广东 深圳 518020)

南方汉族急性髓细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的研究

何柳媚，甄建新，徐筠娉，邓志辉

(深圳市血液中心，广东 深圳 518020)

目的研究和分析南方汉族急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的基因频率和单倍型。方法采用序列特异性引物PCR(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)技术对南方地区76例急性髓细胞白血病患者进行KIR基因的检测和分析，并与77例随机健康对照人群KIR基因频率进行比较。结果共检出16个KIR基因；在AML患者中检出15种基因型，正常人群中检出18种基因型。结论与正常人比较，AML患者各KIR基因频率无显著性差异。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体；急性髓细胞白血病；频率；单倍型；差异

杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)，属免疫球蛋白超家族成员，基因定位于人类第19号染色体LRC区(Human Leukocyte Receptor Complex ，LRC)。 主要表达于NK细胞和部分T细胞，可以特异性识别HLA，从而调控NK细胞核T细胞的杀伤功能。KIR基因家族目前由14个表达基因和2个假基因组成[1]。KIR具有遗传多样性：一方面表现为同一KIR基因座位包含多个等位基因，另一方面又根据KIR基因内容和基因数目的不同分成AA和Bx两类单倍型。随着KIR分子生物学功能的研究深入，KIR分子在恶性肿瘤、病毒感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究[2,3]，倍受研究者的关注。对白种人的观察表明，白血病患者KIR 2DL2频率增高[4]，伊朗学者报道，KIR 2DS3是急性髓细胞白血病的保护性基因[5]。然而，不同种族间KIR基因型的分布有很大差异[6]，为此我们对76例南方汉族人群急性髓细胞白血病患者进行KIR基因分型，并与正常人群进行比较，以探讨KIR与南方汉族人群急性髓细胞白血病的相关性。

1 材料与方法

1.1 样本来源 病例组为经临床检查确诊为急性髓细胞白血病的76例南方汉族患者，静脉血标本EDTA抗凝，于-20℃冰箱中冻存。对照组77例，均为南方汉族健康人群。

1.2 主要试剂 MagneSil Genomic全血基因组DNA提取试剂盒 (美国Promega公司)；KIR geno-typing PCR-SSP试剂盒 (KIR Ready Gene,Inno-Train Diagnostik GmbH,Germany)；Taq 酶 (美 国Promega 公司)。

1.3 主要仪器 Freedom EVO 200全自动DNA工作站 (瑞士TECAN公司)；Biophotometer紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)；9700型PCR扩增仪(美国 ABI公司)；电泳仪(美国 Embi公司)。

1.4 基因组DNA的提取 基于磁珠法，用TECAN DNA工作站提取基因组DNA，测定DNA浓度为30～80g/L，OD260/280为 1.65～1.90。

1.5 按基因分型试剂盒说明书操作。

1.6 PCR产物的电泳 PCR扩增产物经SYBR GreenⅠ染色，用2%琼脂糖凝胶电泳，根据产物有无及特异性条带的片段大小，确定KIR框架基因的有无。

1.7 数据分析和统计 KIR基因频率(GF)计算公式为：GF=1-(1-f)1/2；AML患者与正常人群KIR频率的比较采用χ2检验，软件采用SPSS 11.0统计软件，单倍型频率采用直接计数法。

2 结果

2.1 AML患者与正常人群KIR基因频率及比较：本实验共检测了16个KIR基因。与正常人比较，AML患者各KIR基因频率无显著性差异，详见表1。

2.2 AML患者与正常人群基因型比较 KIR分为两种单倍型组合，AA和Bx。根据http://www.allelefrequencies.net网站上的KIR基因型命名，在AML患者中检出15种基因型，在正常人群中检出18种基因型；基因型9、10、17等8种基因型未在AML患者中检出，7、56、94等5种基因型则未在正常人群中检出；“New?”表示查不到相应的GENOTYPE ID号，是新发现的单体型。AML患者及正常人群中最常见的基因型均为AA(1)型，但在单倍型Bx中，AML患者最常见的基因型为Bx(2)，占7.9%，正常人群最常见的则为Bx(4)及Bx(8)，占10.4%。详见表2。

表1 AML患者与正常对照人群KIR基因频率及差异显著性的比较

表2 AML患者与正常对照人群KIR基因型和单倍型频率

3 讨论

目前白血病在我国是威胁儿童和青少年生命健康最常见的恶性肿瘤之一，它的发生与多种因素有关，其中一些易感基因或免疫应答基因的表达增强和下调及NK细胞的功能异常在白血病的发生和发展中起到了很重要的作用[7，8]。

KIR是继HLA之后发现的人类又一具有高度多态性的免疫遗传系统，截止2011年1月http://www.allelefrequencies.net网站上已经发布了190多个人群的KIR分布情况。由于它具有种族特异性，所以在不同种族或同一种族的不同群体中都存在很大差异。对白种人的观察表明，白血病患者KIR 2DL2频率增高[4]，伊朗学者报道，KIR 2DS3是急性髓细胞白血病的保护性基因[5]，中国也有文献报道，北方地区白血病患者3DL和2DL1比健康对照组显著降低[9]。KIR基因具有丰富的多态性，不同个体所携带的KIR基因数目和种类不同，同一KIR基因座位又有多种不同的等位基因[10]，KIR基因的多态性导致其在不同种族和地区人群中的分布具有显著性差异。从生物遗传学角度讲，我国汉族人群只是文化上而非血缘上的完整群体，因此存在着遗传结构上的差异。根据不同文献报道，不同地区KIR基因频率存在很大差异[11,12]。

对76例南方汉族人群AML患者分析其KIR频率，与77例正常南方汉族人群相比，无显著性差异。这与之前报道的广东汉族人群的结果一致[13]。但是与国内其他地区人群的实验结果不一致[9]。说明不同地区和民族人群的KIR基因和基因频率呈现出很大的不同和区域特点。这正和中国科学院遗传与发育生物学研究所副研究员袁义达，在《中国姓氏：群体遗传和人口分布》一书中指出的一致，汉族南北之间存在着遗传结构上的差异。以我国南方的武夷山和南岭为界，南北两地的汉族血缘相差甚远，南北两地的汉族血缘比南北两地的汉族与当地少数民族的差距还要大。

由AML患者与正常人单倍型频率的图中可看出，在AML患者中检出15种基因型，在正常人群中检出18种基因型；正常人中8种基因型未在AML患者中检出，AML患者则有5种基因型未在正常人群中检出，AML患者及正常人群中最常见的基因型均为AA(1)型，但在单倍型Bx中，AML患者最常见的基因型为Bx(2)，占7.9%，正常人群最常见的则为Bx(4)及Bx(8)，占10.4%。这种基因型的分布差异现象有何生理和病理意义尚待深入研究。此外，KIR与HLA均有高度的多态性，相互间作用较为复杂，有必要进一步探讨不同KIR-HLA组合模式在白血病发病中的作用。

[1]Marsh SG,Parham P,Dupont B,et a1.Killer-cell immunoglobulin like receptor(KIR)nomenclature report,2002[J].Hum lmmunol,2003,64(6):648-654.

[2]Qi Y,Martin MP,Gao X,et al.KIR/HLA pleiotropism:protection against both HIV and opportunistic infections[J].PLos Pathog,2006,2(8):0741-0745.

[3]Khakoo SI,Thio CL,Martin MP,et al.HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving Hepatitis C virus infection[J].Science.2004,305(5685):872-874.

[4]Verheyden S,Bemier M,Demane C.Identification of natural killer cell receptor phenotypes associated with leukemia [J].Leukemia,2004,18(12):2002-2007.

[5]Farhad S,Nader T,Kobra-Zinat E,et al.KIR2DS3 is associated with protection against acute myeloid leukemia.[J].J Immunol,2010,1(7):8-17.

[6]Toneva M,Lepage V,Lafay G,et a1.Genomic diversity of natural killer cell receptor genes in three populations[J].Tissue Antigens,2001,57(4):358-362.

[7]Valiante NM,Lienert K,Shilling HG,et a1.Killer cell receptors:keeping pace with MHC class I evolution[J].Immnol Rev,1997,155:155-164.

[8]李 丹，郗 斌，刘海燕，等.HLA I类基因与白血病相关性研究[J].中国实验血液学杂志，2005，l3:563-566.

[9]陈阿梅，郭晓明，闫文英，等.白血病患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究 [J].中国实验血液学杂志，2007，15(1):35-38.

[10]Gardiner CM,Guetnlein LA,Shilling HG,et al.Differernt NK cell surface phenotypes defined by the DX9 antibody are due to KIR3DL1 gene polymorphism[J].J Immunol,2001,166:2992-3005.

[11]王 槊，王 珏，纪 欣，等.四川骨髓库汉族人群KIR基因多态性研究[J].中国输血杂志，2010，8(23):601-606.

[12]许金环，张建琼，潘 宁，等.中国汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究[J].现代免疫学，2009，4(29):332-336.

[13]尹晓林，邓兰，郭坤元，等.广东汉族恶性血液病患者KIR及其与HLA配伍频率分析[J].免疫学杂志，2006，5(22):549-551.

Study on the correlation of killer immunoglobin-like receptor gene diversity with acute myeloid leukemia in the southern Chinese Han population

HE Liumei,WANG Daming,XU Yunping,et al.Shenzhen Blood Center,Shenzhen Guangdong 518020,China

ObjectiveTo investigate the distribution of KIR gene and haplotype in acute myeloid leukemia of southern Chinese Han population.MethodsA total of 76 patients with acute myeloid leukemia(AML)and 77 randomly-selected healthy controls in the southern Chinese Han individuals were subjected to KIR PCR-SSP genotyping using the inno-train commercial kit.ResultsThe frequency of KIR was not significantly different when compared to the controls.We identified a total of 15 different KIR genotypes in AML patients and 18 in the control individuals.ConclusionThere is no significiant difference between KIR and AML in the southern Chinese Han individuals.

Killer immunoglobulin-like receptor(KIR)；Acute myelocytic leukemia(AML)；Frequency；Haplotype；Difference

R733.7,R343.1+2

A

1674-1129(2012)05-0426-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.003

深圳市科技计划重点项目(201101023)

何柳媚，女，1980年生，汉族，2005年广州暨南大学生命科学院硕士研究生毕业，助理研究员，主要从事免疫遗传学研究。littleduckmei@163.com