加强形态学检查提高细菌鉴定的准确性

陈东科

(卫生部北京医院检验科,北京100730)

加强形态学检查提高细菌鉴定的准确性

陈东科

(卫生部北京医院检验科,北京100730)

细菌形态学的检查是最基本、最简单、最快速、最直观、最经济的常规鉴定方法,对鉴定细菌有“导航”的作用。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学，正确的形态学检验结果是准确鉴定细菌的坚实基础。临床微生物检验技术人员必须掌握一定的形态学知识，这也是基本的从业要求。

细菌；形态学检查；鉴定

随着自动化细菌鉴定仪器的普及使用，细菌鉴定越来越规范，鉴定准确性有了很大的提高。但全自动细菌鉴定仪也不是万能的，那些代谢慢、生化反应弱的细菌很难得以准确鉴定。有些实验室由于过分依赖自动化鉴定仪，对基本的形态学特征、染色特性及鉴别性试验(如触酶、凝固酶、氧化酶等试验)尽量少做或不做，以至于选错鉴定试卡。其结果有两种情况：一是不能鉴定，二是错误的鉴定结果，后一种情况很难被发现，较前一种结果更具危害性。如何避免上述状况的发生，以及提高对少见菌和疑难菌鉴定的准确性，这就需要我们临床微生物检验技术人员加强专业修养，提高业务水平，掌握包括形态学等基础的微生物学知识。

众所周知，鉴定细菌的原则之一就是用最少的试验完成鉴定。细菌形态学检查就是最基本、最简单、最快速、最直观、最经济的常规鉴定方法，也是确认分离菌株的参考方法之一[1-5]。对细菌形态学的正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂、操作技巧等[6]。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学[7]。

1 细菌的菌落特征

细菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小(分大、中、小，以1mm为界)、形状、高度、边缘、表面状态、密度(透明度)、硬度 (用接种环刮取菌落时的感觉)、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血、气味和色素产生情况等特性。观察细菌的典型形态，应该是将细菌接种在该细菌最适生长的培养基上、放入该细菌最适生长环境中(包括温度和所需气体条件)进行孵育，孵育时间应视细菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24h为宜，有些细菌需要更长时间的孵育才能显现出典型的菌落特征。有时为了鉴别某一种或某一类细菌，需要观察细菌在特殊的培养基(包括显色培养基)上或在特定环境下(气体、温度和光线等)培养的形态特征。观察菌落特征的目的是为了对细菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝样菌落(见封三图1所示)、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构(见封三图2所示)、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌(及黄色单胞菌和金色单胞菌)的皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落、嗜麦芽窄食单胞菌的“猫眼”菌落、铜绿假单胞菌的水溶性色素、紫色色杆菌的脂溶性色素(见封三图3所示)、沙雷菌的红色色素(见封三图4所示)、产吲哚金黄杆菌产生的吲哚气味、嗜血杆菌产生的鼠穴气味、诺卡菌产生的腐土气味、厌氧菌产生的腐氨气味、荧光假单胞菌产生的黄色荧光素、某些厌氧菌可产生砖红色荧光素等。有些细菌产生色素受到气体的影响(粘质沙雷菌在厌氧环境下不产色)，有些细菌产生色素受到光线的影响(某些快速生长分枝杆菌是光产色或暗产色)。对细菌菌落特征的观察、描述和计数是细菌鉴定的第一步骤，其主要目的体现在以下几方面。

1.1 对病原菌的定量或半定量分析 在对标本进行定量或半定量接种后，通过菌落计数可获得定量或半定量结果，细菌的定量在尿液分析和疗效动态观察中具有临床意义，半定量适用于开放性标本的结果分析(确定优势菌)。

1.2 病原菌的确定 开放性标本受炎症组织周围皮肤、黏膜的常居菌丛污染的可能性较大，观察培养结果时应根据标本直接涂片镜检结果，结合菌落形态特征来确定病原菌。

1.3 血培养结果解释 分析阳性血培养瓶的转种结果时，应结合对阳性培养液直接涂片的镜检结果，如果涂片结果与培养结果不符，应考虑操作错误或是污染所致。

1.4 确定鉴定方向 根据不同培养基上的菌落形态特征，结合革兰染色镜检结果及快速辅助试验(氧化酶、触酶、凝固酶等)结果，可做初步判定，并确定后续鉴定方向。

2 细菌的菌体形态特征

临床微生物学实验室仍然使用细胞形态学的方法进行细菌鉴定，革兰染色细胞形态学是细菌分类学的基础。掌握细胞形态学的标准方法能够为准确鉴定细菌提供可靠保证。很难想象革兰染色的错误会导致正确的鉴定结果。对细菌菌体形态特征的观察和描述是细菌鉴定的第二步骤，其主要目的体现在以下几方面。

2.1 可解释培养结果、确定鉴定方向 无论是液体培养(如血培养、标本直接增菌培养)或是固体培养(接种培养皿)，都应该将培养物进行涂片、染色镜检确定培养物的性质，既可快速报告，也是为下一步的鉴定指明方向。图5(见封三)所示为血培养阳性培养物涂片革兰染色镜检结果，形态学需区分诺卡菌与放线菌，经改良抗酸染色结果为阳性(见封三图6所示)，可确定该菌是诺卡菌属某种。

2.2 是鉴别细菌的手段 细菌菌体形态结合菌落形态特征可对细菌进行初步鉴定。例如，在选择性巧克力平板(加万古霉素)上生长的草绿色溶血菌落，是乳杆菌还是肠球菌(VRE)只要涂片镜检就很容易区分；鲍曼不动杆与克雷伯菌属细菌的菌落形态相似，镜下区别前者为革兰阴性球杆菌(接近球菌)，后者为革兰阴性杆菌；丹毒丝菌在血平板上的菌落形态与草绿色链球菌很相像，但镜下形态差别很大。图7(见封三)所示为红斑丹毒丝菌的革兰染色镜下形态。

2.3 是鉴定方向及试剂选择的依据 葡萄球菌和链球菌、革兰阳性球菌和革兰阳性杆菌、芽孢杆菌和非芽孢杆菌、革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌的鉴定方向完全不同，试剂选择也不同，如果选错试剂结果必然是错误的，有些错误的结果很难被发现，最终导致临床治疗的失败。

2.4 是药敏组合选择的依据 CLSI文件规定，每一种细菌都有一定的抗菌药物组合供选择。要准确进行药敏组合选择，就必须有准确的细胞形态学结果作支持。如果把球菌和杆菌、革兰阴性和革兰阳性细菌混淆了，最终结果将会出现偏差，报告临床的后果不堪设想。

3 菌体特殊结构的观察

3.1 荚膜 荚膜是某些细菌在细胞壁外包裹的一层粘液性物质，一般由多糖和多肽组成。荚膜作为细菌的毒力因子有必要对其染色观察，荚膜肿胀试验可特异性的鉴定细菌。

3.2 鞭毛 鞭毛是细菌的运动器官，观察细菌鞭毛对于细菌鉴定有十分重要的意义。依据鞭毛的有无、位置和数量，细菌分为无鞭毛菌、单端极鞭毛菌、单端双鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌等。临床实验室可用动力试验验证细菌鞭毛的存在，但动力试验无法代替鞭毛染色在细菌鉴定中的地位。

3.3 芽孢 芽孢是芽孢杆菌休眠期的一种特殊形态。芽孢的形态包括芽孢形状、芽孢位置和孢子囊膨大。芽孢形态分为圆柱形、椭圆形、球形，芽孢位置分为端生、近端生、中生或近中生。根据芽孢的形态学可以对芽孢杆菌属和梭菌属进行初步鉴定。芽孢杆菌的鉴定有专用的试剂，不可与其他细菌的鉴定试剂混用。观察芽孢的方法很多，有染色法和直接观察法。但芽孢染色并不优于革兰染色，使用相差显微镜观察芽孢优于芽孢染色和革兰染色。图8(见封三)所示为艰难梭菌芽孢染色结果。

3.4 异染颗粒 异染颗粒其主要成分是多聚偏磷酸盐，可随菌龄的延长而变大。多聚磷酸盐颗粒对某些染料有特殊反应，产生与所用染料不同的颜色，因而得名异染颗粒。如用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色后不呈蓝色而呈紫红色。棒状杆菌和某些芽孢杆菌常含有这种异染颗粒。常见于白喉棒状杆菌，位于菌体两端，故又称极体，有助于该菌的鉴定。

4 细菌形态学是微生物实验室报告审核的重要依据

对检验结果的审核是临床微生物实验室检验流程的最后一道工序，应该由技术全面的技术人员进行把关。审核报告应该从检验申请单、感染部位选择、标本的采集与处理、标本直接涂片镜检结果的描述、标本的接种和孵育、菌落形态观察和描述、菌落涂片镜检结果描述、附加试验的选择及结果判断、免疫学试验结果分析、生化试剂的选择与结果观察记录、专家系统提示内容解读、抗菌药物组合的选择和结果分析、以及室内质控结果等全过程进行综合分析，必要时还应征求临床医生对疾病诊断的意见，了解患者病情及用药的相关信息。最终鉴定结果须与形态学结果相符，如果出现不符合结果，尤其在药敏试验结果与鉴定结果相矛盾时(既无法解释的耐药机制)，首先应审核鉴定结果与形态学结果是否相符，如果结果不相符，应该审核整个检验过程，找到问题所在，并重新进入鉴定程序。

综上所述,细菌形态学的检查,对鉴定细菌有“导航”的作用，正确的形态学检验结果是准确鉴定细菌的坚实基础。这就要求每一位从事临床微生物检验的技术人员必须掌握一定的形态学知识，并在实际工作中不断学习、总结提高，早日成为一名优秀的临床微生物检验工作者，为临床治疗感染性疾病提供优质服务。

[1]Murray PR.Manual of clinical microbiology[M].10th ed.Washhington DC:American Society for Microbiology Press,2011:3-209.

[2]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京：东南大学出版社，2006:720-753.

[3]蔡文诚,蔡岳廷.实用临床微生物诊断学[M].第10版,台北：九州图书文物有限公司出版,2011:1-146.

[4]过祥豹.原始标本涂片检查对微生物检验全过程的导航作用.临床检验杂志 2002，20(特刊)：25-28.

[5]谷海瀛.形态学检查方法的标准化及其在细菌鉴定中的作用.中华检验医学杂志 2006，29(10)：951-953.

[6]Isenberg,HD.Clinical microbiology procedures handbook [M].2th ed.Washington DC:ASM,2004.

[7]陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京：人民卫生出版社,2011:169-568.

图1 肺炎链球菌

图2 伴放线凝集杆菌(透射光×4)

图3 紫色色杆菌

图4 深红沙雷菌

图5 血培养-诺卡菌(革兰染色×1000)

图6 血培养-诺卡菌(改良抗酸染色×1000)

图7 红斑丹毒丝菌(革兰染色×1000)

图8 艰难梭菌(孔雀绿染色×1000)

Improvement of the bacterium identification accuracy by morphological examination

CHEN Dongke.Department of Clinical Laboratory,Beijing Hospital of the Ministry of Health,Beijing 100730,China

The bacterial morphology examination,including bacterial cell morphology and bacterial colony morphology,is a routine method for bacteria identification with simple,fast,observable,and economic characteristics and plays a"navigation"role in bacterial identification.Accurate bacterial morphology examination results are the basis for identification of bacteria correctly.Clinical microbiological technicians need to have some bacterial morphology examination knowledge to improve the accuracy of bacterial identification.

Bacteria;Morphological examination;Identification

R446.5

A

1674-1129(2012)05-0419-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.001

陈东科，1961年5月生，男，副主任检验师，主要从事病原微生物形态学、疑难菌鉴定、抗生素药效学研究。