HLA-DRB1基因与发作性睡病的关系

陈德宝 万汝根 楼永刚 王茂峰

(东阳市人民医院,浙江 东阳 322100)

发作性睡病(narcolepsy)是一种终生性睡眠疾病,常于青春期前起病。典型特征为白天过度嗜睡、夜间睡眠紊乱以及病理性快速眼动睡眠(REM),还可并发猝倒、睡眠幻觉、耳鸣、忧虑、焦虑、记忆力减退等症状[1-4]。近年来国外已有关于发作性睡病与HLA抗原基因相关性的研究报道[5-7]。本研究用序列特异性引物的聚合酶链反应(PCR-SSP)对发作性睡病及健康人HLA-DRB1等位基因进行检测,以了解特异性发作性睡病的遗传易感基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年1月～2011年4月来本院就诊的特异性发作性睡病组:中国汉族患者28例,均符合发作性睡病诊断标准:参照睡眠障碍国际分类(ICSD)[8-9],并结合发作性睡病的临床特征:(1)患者有白天过度嗜睡或突然肌无力主述;(2)每天有频繁小睡或突然进入睡眠状态;(3)多导睡眠图(polisomnography,PSG)记录:睡眠潜伏期小于10分钟;快速眼动睡眠潜伏期小于20分钟;多次睡眠潜伏期试验(MSLT)中平均睡眠潜伏期小于5分钟;两次以上睡眠开始时REM发作。其中男22例,女6例;年龄12～41岁,平均 19岁。对照组:为与患者同地区、无血缘关系、无特异性发作性睡病发病史及无睡眠呼吸暂停综合征的健康人群,共36例,两组性别、年龄具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 Taq DNA聚合酶(美国QIAGEN公司)、Qiagmp DNA Blood Mini Kit(美国QIAGEN公司)、HLA-DRB1基因分型试剂盒(德国BAG公司)。PCR自动扩增仪(GeneAmp 9700,ABI,USA)、微量凝胶电泳系统(Abgeme,英国)、紫外分光分析系统(MultiImageTM,Aipha Innotech Corporation)。

1.2.2 基因组DNA的制备 应用DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞中的DNA。取5μL的DNA样品,用紫外分光光度法检测样品的A值及纯度,最后DNA调准为80μg/mL。

1.2.3 实验方法 应用PCR-SSP(polymerase chain reaction/sequence primers)方法检测HLA-DRB1位点的基因型。将含有DNA、Taq DNA聚合酶、PCRMix的混合液以每孔10μL的量加入HLA-DRB1基因分型板的24个含特异性引物的小孔。PCR扩增条件为96℃预变性120秒,63℃退火和延伸55秒,1个循环;96℃变性10秒,63℃退火和延伸50秒,9个循环;96℃变性10秒,59℃退火55秒,72℃延伸30秒,20个循环。

1.2.4 基因型的确定 以1%的琼脂糖凝胶电泳,120V稳压12分钟。紫外灯下观察,根据PCR产物的有无及分子量大小对照HLA-DRB1基因分型格局表确定基因型别。

1.3 统计学处理 直接计数法计算基因频率。基因频率(%)=(实际检出数/被检人数)×2。两组间基因频率的比较采用 χ2检验。P值均用Bonferroni法进行校正。

2 结 果

共检出13种基因型。每例HLA-DRB1座位上有两个等位基因,故统计分析了发作性睡病组中56个基因与正常对照组中72个基因。患者组DRB1*15基因频率(51.8%)较正常对照组(16.7%)明显增高,经统计有显著性差异(χ2=17.84,P＜0.01),患者组其它基因频率与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05),见表1。

表1 发作性睡病组与正常对照组HLA-DRB1基因分布

3 讨 论

DRB1是HLAⅡ类基因主要的表达位点,最显著的特征是具有明显的多态性。DRB1是决定宿主免疫应答能力最重要的遗传因素,其产物决定不同个体对抗原免疫应答的差异,并影响着病情进展[10-11]。本研究采用 PCR-SSP方法对HLADRB1等位基因进行了检测,结果显示HLA-DRB1*15在发作性睡病组及正常对照组中的基因频率分别为51.8%和16.7%,经统计学分析有显著性差异(P＜0.01)。此结果进一步证实了HLA-DRB1*15为发作性睡病的易感基因,这与国外其他学者的研究一致[12]。肖毅等[13]研究了10例发作性睡病患者,结果显示HLA-DRB1*1501为该疾病的易感基因,与国外其他学者的研究一致。HLA-DRB1*15可细分成多个等位基因,HLA-DRB1*1501是DRB1*15的最常见基因。

不同的HLAⅡ类基因产物参与递呈不同的抗原肽,并诱发出特异性和强度不同的免疫应答。HLA-DRB1*15可能在免疫应答过程中起重要的调控作用,使T细胞激活,导致免疫反应增强,参与发作性睡病病变的形成。HLAⅡ类分子在自身反应性T细胞的成熟中以及T细胞活化和免疫识别中起重要作用。HLA具有高度多态性,不同的HLA分子因结构上的差别,特别是抗原结合部位上某些氨基酸残基的不同,在一定程度上决定了HLA分子对自身抗原的亲和力,从而直接影响它们递呈抗原肽并激活特异性T细胞的能力。据此推测,可能是这一类将自身抗原递呈给抗原特异性T细胞的特殊HLA分子携带着发作性睡病的遗传易感性,且可影响病情进展。

本组结果显示HLA-DRB1*15基因为中国发作性睡病患者的易感基因,可以辅助该疾病的诊断。但发作性睡病在中国人群的发病率只有0.04%[14],要对发作性睡病患者作进一步的诊断和治疗尚需更大的样本量及更深层次的探索。

[1] Michelle Cao Do.Advances in Narcolepsy.Med Clin North Am,2010,94(3):541

[2] Dauvilliers Y,Tafti M.Molecular geneticsand treatmentof narcolepsy.Ann Med,2006,38(4):252

[3] 张瑛,沈沸.发作性睡病治疗及进展.医学研究杂志,2010,39(9):117

[4] 韩芳,Mignot E,魏翠英,等.呼吸中枢化学反应性、发作性睡病与HLA-DQB1:0602基因.中华结核和呼吸杂志,2011,34(3):186

[5] Hauw J J,Hausser-Hauw C,De Girolami U,et al.Neuropathology of sleep disorders:a review.J Neuropathol Exp Neurol,2011,70(4):243

[6] Kawashima M,Tamiya G,Oka A,et al.Genomewide association analysisof human narcolepsy and a new resistance gene.Am J Hum Genet,2006,79(2):252

[7] Taeko Sasai,Yuichi Inoue,Yoko Komada,et al.Comparison of clinical characteristics among narcolepsy with and without cataplexy and idiopathic hypersomnia without long sleep time,focusing on HLADRB1*1501/DQB1*0602 finding,Sleep Medicine,2009,10(9):961

[8] American Sleep disordersassociation.International classification classification of Sleep disorders.In:Diagnostic and coding manual.Minnesota:American Sleep disorders Association,2001:22

[9] Vignatelli L,Plazzi G,Bassein L,et al.ICSD diagnostic criteria for narcolepsy:terobserver reliability.International Classification of Sleep disorders.Sleep,2002,25:193

[10]Ichiki Y,Aoki CA,Bowlus C L,et al.T cell immunity in autoimmune hepatitis.Autoimmune Rev,2005,4(5):315

[11]Thorsby E,Lie B A.HLA associated gene tie predisposition to autoimmune diseases:Genes involved and possiblemechanisms.Trample Immanuel,2005,14(2):175

[12]Wing Y K,Chen C N,Ho C K.HLA-DR2 and DQ1 frequency among narcoleptic patients in Hong Kong Chinese.Psychiatry Clin Neurosci,1998,52:523

[13]肖毅,黄席珍,邱长春,等.HLA-DRB基因多态性与发作性睡病.中华内科杂志,1999,38(11):757

[14]Han F,Chen E Z,Wei H L,et al.Childhood narolepsy in north China.Sleep,2001,24:321