红树植物秋茄ISSR条件的优化

章宏琼，杨娟，周云，宋佳楠，朱忆思梦，施孟如，张洪勤

（温州医学院，浙江 温州 325035，1.仁济学院；2.生物学实验教学中心）

红树植物秋茄ISSR条件的优化

章宏琼1，杨娟1，周云1，宋佳楠1，朱忆思梦1，施孟如2，张洪勤2

（温州医学院，浙江 温州 325035，1.仁济学院；2.生物学实验教学中心）

目的：探讨红树植物秋茄简单序列重复区间扩增多态性分子标记（ISSR-PCR）分析的最优条件，以获得清晰、重复性好的简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）扩增结果。方法：对ISSR-PCR多个条件中的单个条件包括DNA的提取、模板浓度、Taq酶的选择与用量、Mg2+和三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）浓度等进行了比较、优化。结果：从单条件中得出每个条件的最优条件，从而获得清晰、重复性高的电泳图谱。结论：秋茄ISSR-PCR分析最适宜的扩增条件为：25μL PCR反应体积中，0.75～1.0 U Taq DNA聚合酶，0.8μmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP，2.0～2.5 mmol/L MgCl2，40 ng/μL模板DNA。

红树科；秋茄；简单序列重复区间；条件优化

红树林是处于亚热带、热带海洋与陆地过渡带的特殊生态系统，是海岸带的生态关键区，具有抵抗海啸和台风、调节区域气候、维护生物多样性等重要生态功能[1]。秋茄（Kandelia candel）是我国分布最广的常见红树植物，其天然分布最北至福建福鼎市，人工种植最北至宁波象山港，全世界最北分布的红树植物也是秋茄[2]。

简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA分析由Zietkiewicz等[3]于1994创建，是建立在PCR反应基础上的一种新的分子生物学技术，它把随机扩增多态性DNA分子标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和微卫星标记（simple sequence repeat，SSR）的优点相结合，不但具有RAPD所需DNA量少、操作简单、不需预知研究对象的基因组序列等优点，而且具有SSR的稳定性[4]。因此，ISSR近年来已迅速应用于遗传多样性的研究、种质资源研究和品种鉴定，成为构建遗传图谱的重要工具之一[5-6]。尽管ISSR扩增技术原理简单，但由于PCR条件的变化，往往会出现不同的扩增结果，其影响因素主要有：Mg2+的浓度、三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）浓度、Tag酶和DNA模板的浓度。

本研究通过对ISSR-PCR实验条件的优化，建立重复性好、结果清晰而稳定的秋茄ISSR的实验参数，为进一步研究红树植物秋茄种群的遗传变异和规律奠定良好的基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料的采集与处理 秋茄叶片采自厦门漳江口、温州西门岛和宁波象山港。在选定的三个不同纬度居群中每隔5～10 m选择长势良好的植株，采集当年生的展开完全的幼嫩叶片（倒二叶）每树10片，用棉花蘸取足够的水分包住茎枝条的基部，为保持叶片新鲜不变质，必须迅速放冰上保存，处理待测，并于-20 ℃冰箱内保存。

1.2 实验仪器与试剂 BID-RAD Gel Doc凝胶成像分析仪（美国，BIO-RAD公司）；Sartorius BT124S电子分析天平（上海恒刚仪器仪表有限公司）；MILLIPORE F5CN29159超纯水制备系统（美国，Millipore公司）；Hybaid Px2PCR梯度扩增仪（Thermo公司）；NanoDrop 2000（Thermo公司）；Taq酶（大连宝生物）；ISSR引物、DNA分子marker（上海捷瑞）；其余琼脂糖粉末、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等常用试剂均为国产分析纯。

1.3 秋茄DNA的提取及检测 秋茄叶片总DNA采用改良后的CTAB法[7]提取（2% CTAB，0.1 mol/L Tris HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% β-巯基乙醇），获得的DNA由NanoDrop 2000测定其浓度及纯度。根据基因组DNA浓度值将样品分别稀释至10、20、30、40、60 ng/μL用于ISSR-PCR。

1.4 ISSR-PCR反应 PCR扩增体系:反应体系中含10× PCR Buffer（Mg2+free）、dNTP mixture（2.5 mmol/L）、引物（10μmol/ L）、DNA（30～50 ng）、TaKaRa Taq（5 U/μL），最后加ddH2O至25μL，用漩涡混合器对所加的各组分进行混合。扩增程序：94 ℃预变性5 min，之后进行45个循环，每个循环包括94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，最后于72 ℃再延伸7 min。将扩增产物置于4 ℃冰箱保存。将PCR扩增产物用1×TAE配制的琼脂糖凝胶电泳分离，以DNA ladder Marker（100～2000 bp） 作为相对分子质量标准，在恒定电压下电泳，电泳结束后在电泳凝胶成像系统中观察记录扩增产物的泳带，并保存图像。

2 结果和讨论

2.1 DNA提取 本实验提取的DNA呈无色絮状沉淀，电泳显示该DNA完整，并无明显降解（见图1）。将DNA溶液稀释后用TE缓冲液为空白对照测其在260 nm及280 nm波长的紫外吸收，其紫外吸收比值（A260/280） 为1.89～1.93。结果显示改良后的CTAB法是一种提取后DNA所含杂质少、提取方法简单的基因组DNA提取方法。所提取的秋茄DNA由NanoDrop 2000测定其浓度及纯度。根据基因组DNA浓度值将样品稀释至特定浓度用于ISSR分析。

图1 三个居群部分个体的总DNA

2.2 模板DNA浓度 模板DNA浓度是影响ISSR-PCR扩增的主要因素之一。本次实验对比了6种用于PCR反应的模板DNA浓度（分别为10、20、30、40、50、60 ng/μL）。结果显示，模板DNA的浓度对ISSR结果有明显的影响，当模板DNA的浓度为10 ng/μL时条带不多，而在30～50 ng/μL时均扩增出基本相同的带型，但当浓度升到至60 ng/μL时扩增的ISSR谱带反而减少。所以在检测秋茄遗传多样性研究中，我们采用的DNA模板浓度为40 ng/μL。

2.3 引物浓度 引物合适的终浓度可在0.1～1.0 μmol/L之间选择。在控制其他条件一致时，我们设置了0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L的一系列引物浓度梯度，结果表明，引物浓度太低时（0.2～0.4μmol/L），扩增产物太少甚至无扩增条带；引物浓度太高时，又容易出现非特异性扩增反应。实验结果（见图2）证明，在引物浓度为0.8 μmol/L时条带最清晰，因此，在秋茄ISSR-PCR实验中，引物浓度为0.8μmol/L最佳。

图2 不同模板DNA质量浓度的ISSR扩增结果（引物BW09481HAP）

2.4 Taq酶浓度 在ISSR-PCR的反应体系中，Taq酶的用量会直接导致ISSR-PCR扩增反应的成功与否。当其他反应条件一致时，我们对比设置了0.5、0.75、1.0、1.5 U的梯度Taq酶用量，结果表明，0.5 U酶含量过低，产物的合成效率极低，无扩增产物出现；0.75～1.0 U可以得到重复的清晰条带，而且无非特异性扩增；而1.5 U酶含量则过大，虽然能够得到扩增产物，但是出现大量的非特异性扩增，同时扩增产物主带相连，分离效果低，模糊难以辨认。因此，在秋茄ISSR-PCR实验中，Taq酶的使用量在0.75～1.0 U范围内为最佳。

2.5 Mg2+浓度 Mg2+浓度也是ISSR-PCR的一个重要影响因素。Mg2+作为Taq酶的辅助因子，其浓度不仅可以影响反应液中的dNTP、模板DNA及引物结合效率，也会影响Taq酶活性，影响模板与PCR产物的解链温度以及引物二聚体的形成和产物的特异性[8]。本实验对所采用的每个引物均设置了Mg2+浓度梯度的比较，即1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L。结果表明，在ISSR-PCR反应液中，当Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，无扩增产物出现；浓度为2.0～2.5 mmol/L时能得到清晰重复性好的条带，而且无非特异性扩增；当浓度为3.0～3.5 mmol/L时虽然也能得到扩增条带，但是条带变少，而且具有非特异性扩增。所以，Mg2+浓度我们采用2.5或2.0 mmol/L，但是不同的引物对反应系统中的Mg2+浓度要求不同，根据引物而决定其浓度。在一般的秋茄DNA的PCR反应中，2.0～2.5 mmol/L Mg2+较为合适[9]。

2.6 dNTP浓度 dNTP为ISSR-PCR反应提供原料。为了确定最适合的dNTP量，分别设置0.12、0.16、0.20 mmol/L的dNTP浓度梯度（Mg2+浓度设定为2.0 mmol/L）。结果表明，dNTP浓度为0.20 mmol/L时能得到清晰的条带，而且没有非特异性扩增；当dNTPs的浓度过低（低于0.20 mmol/L）时，会出现条带不清晰或非特异性扩增条带；当浓度高于0.20 mmol/L时，条带数量会急剧减少甚至全部消失，可能是因为dNTP浓度过高会螯和大量Mg2+从而造成Taq DNA聚合酶活性降低，最终导致扩增量减少甚至整个反应失败[10]。所以我们认为dNTP浓度为0.20 mmol/L是秋茄ISSR的最佳浓度。

影响ISSR结果的因素很多，本次实验采取单因素方法来优化条件，结果显示每个单因素的优化并不能使ISSR-PCR有最好的结果。综合多个单因素优化条件得出红树植物秋茄ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件是：25μL PCR反应体积中，0.75～1.0 U Taq DNA聚合酶，0.8μmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP，2.0～2.5 mmol/L MgCl2，40 ng/μL模板DNA。我们利用此优化系统，顺利地从9个引物中筛选出扩增条带清晰、重复性好的4个引物（BW09461HAP、BW09480HAP、BW09481HAP、BW09492HAP）作为正式扩增的引物。结果表明优化后的PCR反应体系中秋茄3个居群，24个个体均可扩增出明显条带。图3为选用BW09481HAP引物（CTCTCTCTCTCTCTCTRG），对三个居群的24个个体进行ISSR-PCR扩增，得到清晰、多态性高的ISSR带谱，并具有较好的重复性。而图4为引物BW09497HAP对24个个体的ISSR-PCR扩增结果，对比可见图4的ISSR带谱没有图3清晰、重复性好，由此可知：只有进行了PCR条件的优化才能进行引物的筛选，筛选出适合该物种的引物，进行下一步研究。

图3 优化的ISSR-PCR系统对三个居群（宁波、温州、厦门）24个体扩增的ISSR带型（引物BW09481HAP）

图4 优化的ISSR-PCR系统对三个居群（宁波、温州、厦门）24个体扩增的ISSR带型（引物BW09497HAP）

综上所述，本研究优化了秋茄植物ISSR的反应体系和程序，并筛选出适宜秋茄种质资源分子鉴定的ISSR引物，这将为更好地利用秋茄种植资源进行育种及相关研究提供帮助。

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Q503

B

1000-2138（2012）06-0566-03

2012-05-14

章宏琼（1990-），女，浙江三门人，本科生。现工作单位为台州市三门县恒康制药有限公司。

张洪勤，高级实验师，Email：zh429@126.com。

丁敏娇）

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