浙南忍冬属药材rbcL基因序列分析

李小侠，陶正明 ，吴志刚 ，林新春，范传颍

（1.浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005；2.温州医学院 药学院，浙江 温州 325035；3.亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 311300）

浙南忍冬属药材rbcL基因序列分析

李小侠1，2，陶正明1，2，吴志刚1，林新春3，范传颍1，2

（1.浙江省亚热带作物研究所，浙江 温州 325005；2.温州医学院 药学院，浙江 温州 325035；3.亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 311300）

目的：分析浙南忍冬属药用植物叶绿体rbcL基因序列，探讨其差异。方法：Primer Premier 5.0设计引物，用于rbcL基因PCR扩增，ClustalX1.83进行序列全比对。MEGA 4.0分析转换值、颠换值等；以七子花Heptacodium miconioides为外类群，邻接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大简约法（Maximun Parsimony，MP）进行聚类分析（models：p-distance）；自展法（Bootstrap）检验各分支可信度。结果：5种忍冬属药材rbcL基因片段长度在1143～1167 bp之间，手工校正后长度为1137 bp，保守位点1126个，变异位点11个，简约信息位点6个，碱基转换和颠换分别为3和2，比值为1.6；MP和NJ两种方法所得结果几乎一致，均将5种忍冬属药材分为两大支，黄褐毛忍冬与忍冬为第一大支，红腺忍冬、华南忍冬和灰毡毛忍冬为第二大支。结论：rbcL基因能够从分子水平揭示5种忍冬属药材的差异，为忍冬属药材鉴定以及系统发育提供重要参考依据。

忍冬属；rbcL；序列分析；聚类分析

忍冬属（LoniceraLinn）植物隶属于忍冬科，为直立或攀援状灌木，落叶或常绿、半常绿，全世界约有200种，中国有98种分布。其中忍冬Lonicera japonicaThunb.为《中国药典》[1]中金银花的唯一基原植物；灰毡毛忍冬Lonicera macranthiodesHand-Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、华南忍冬Lonicera confusa（Sweet） DC.以及黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng.为山银花4种基原植物。由于金银花与山银花在外形上较为相似，市场上常有不法商贩将山银花冒充金银花以高价出售，严重干扰了中药材质量，为此，近几年学者针对金银花和山银花形态学以及化学成分等方面进行了研究[2-5]。但从分子水平寻找两类药材区别的报道较为罕见。陈大霞等[6]利用SRAP技术仅对灰毡毛忍冬自然群体遗传多样性进行了报道，王晓明等[7]、杨飞等[8]利用ISSR、RAPD技术对金银花进行了遗传多样性研究，朱颖等[9]利用ITS序列对部分忍冬属植物进行了系统发育研究，取得良好结果，但对药典收录的5种忍冬属药材仅限忍冬和华南忍冬两种。迄今，对于药典收录的5种忍冬属药材分子水平差异以及系统发育等研究鲜见报道，特别是浙南地区分布有忍冬属多种药材资源，栽培历史已久，但鲜见对其进行研究报道。

由于叶绿体基因组较小、单亲遗传，且不受基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的遗传路线，不依赖于其他任何数据即可构建分子系统树[10]，因此，叶绿体基因组逐渐成为分子进化和分子系统学研究的焦点。编码核糖体1，5-二磷酸羧化酶的rbcL基因在植物叶绿体基因组中相对保守，是分子系统学研究中普遍应用的基因之一，目前已成功应用于属间和属内种间系统关系的研究[11]。本研究从分子水平对5种忍冬属药材rbcL基因进行分析鉴定，以期为浙南地区忍冬属药材的品种鉴定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料 实验材料来自5种药用忍冬属植物，野外采集其植物叶片，迅速用硅胶干燥备用，所有样本均经浙江省亚热带作物研究所陶正明副研究员鉴定（详见表1）。

表1 实验样本

1.2 DNA制备 采用CTAB法提取DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。DNA浓度检测仪测定其浓度和纯度，统一稀释至20 ng/μL，备用。

1.3 rbcL片段的获取 Primer Premier 5.0软件设计引物，扩增rbcL基因片段，引物序列为：rbcLF：5’-TATCTTAGCGCCATTCCGAGTA-3’；rbcL-R：5’-CGCGGATAATTTCATTACCTTC-3’，并由上海Songon生物公司合成序列。

PCR扩增体系为：体系总体积20μL，其中10×Buffer（with Mg2+）2μL，dNTP（2.5μmol/L）1.6μL，Taq（5 U/μL）0.2μL，Primer（10μmol/L）1μL，DNA模板（20 ng/μL）3μL。PCR扩增程序：1个循环的94 ℃预变性3 min；35个循环的94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃复性60 s；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，2000 DL Marker为分子标记物，经检测，目的条带合格（见图1），将其送华大基因公司纯化并测序，测序方式使用两端测序。

1.4 数据分析 使用SEQMAN对rbcL序列进行编辑和拼接。ClustalX1.83比对序列，手工去除两端测序不准确碱基，将校正后序列提交至GenBank数据库（GenBank Acc.No.见表1）。MEGA 4.0分析碱基序列，以七子花为外类群，邻接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大简约法（Maximun-Parsimony，MP）构建5种忍冬属药材聚类图（models：pdistance），Bootstrap检验聚类图各分支可信度，重复次数设为1000。

图1 rbcL基因片段的扩增

2 结果

2.1 碱基分析 5种忍冬属药材rbcL基因片段长度在1143～1167 bp之间，最长序列为华南忍冬，共测得1167个碱基，最短序列为忍冬，测得1143个碱基，二者长度仅相差24个碱基。经手工去除两端测序不准确碱基后长度为1137 bp。

MEGA 4.0分析5个忍冬属药材rbcL序列碱基含量情况（见表2），其中黄褐毛忍冬含碱基T少于其余品种；碱基A的含量华南忍冬为25.50，略低于其余种；碱基C的含量属忍冬最少，为24.98，其次为黄褐毛忍冬，其余种为25.15；碱基G的含量则是忍冬和黄褐毛忍冬的多于其余种；由以上数据发现，碱基含量变异主要体现在忍冬、黄褐毛忍冬与其余种之间。GC含量值差异不大，整体稳定在45.6%左右。碱基转换和颠换分别为3、2，二者比值为1.6，小于临界值2.0，表明rbcL在这5个忍冬属间相当保守，适用于系统发育方面的研究。

表2 碱基组成

ClustalX1.83进行序列比对后，获得保守位点1126个，变异位点11个，简约信息位点6个，说明rbcL基因在这5个忍冬属药材中是相当保守的。变异的11个位点在整个序列中的分布不平衡（见图2），根据碱基变异情况，大致将整条rbcL片段分成3个区域：第一个区域为1～310 bp处，为保守区，此区域只有第144位发生一个碱基变异；第二个区域为311～582 bp处，此区域为高度变异区，在这个区域的272个碱基中，发生变异的有9个，占所有变异碱基的82%；第三个区域为583～1137 bp处，此区域只在第1050位点处发生一个碱基变异。由此看出，碱基变异的发生具有一定的不均衡性。

图2 变异位置示意图（1137 bp）

图3 基于rbcL序列构建的NJ（a）、MP（b）聚类图

2.2 聚类分析 基于5种忍冬属rbcL序列形成的遗传相似系数，使用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）两种方法来构建其聚类图，以七子花为外类群，利用1000次重复抽样，两种聚类图个分支可信度均超过50%（见图2）。MP和NJ所得结果几乎一致，均将5种忍冬属药材分为两大支，黄褐毛忍冬与忍冬为第一大支，其分支支持率分别是57%（NJ）和81%（MP），第二大分支包括两个组，华南忍冬单独为一组，其分支支持率分别为97%（NJ）和79%（MP），红腺忍冬和灰毡毛忍冬为一组，NJ和MP 对其分支支持率均为79%。

3 讨论

3.1 山银花4种基原植物关系

3.1.1 红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬：2010版《中国药典》定义山银花植物来源有4种，即红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬以及黄褐毛忍冬。本实验研究发现，红腺忍冬与灰毡毛之间序列完全相同，无碱基变异，二者与华南忍冬仅在第144 bp处出现碱基替代。据李建军等[4]对山银花性状研究：红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬花的萼筒均呈椭圆形，花丝均无毛，华南忍冬萼筒有毛，与其余二者相反；华南忍冬密被糙毛及腺毛，与灰毡毛忍冬和红腺忍冬疏毛形成对比；灰毡毛忍冬腺毛较少，与红腺忍冬和华南忍冬多腺毛形成对比。以上形态学特征表明，红腺忍冬与灰毡毛忍冬之间差异很小，二者与华南忍冬有一定差别。由NJ和MP产生的聚类图将3者聚为一支的支持率达到97%（NJ）、79%（MP），且支内进一步分出两支，华南忍冬单独为一支。3条序列的碱基差异以及进化树的特征从分子水平揭示了这一形态学特点。但由于叶绿体基因本身相当保守，致使rbcL基因序列几乎无差别，不能深度区分红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬较近的亲缘关系，因此，对于这三者的进一步鉴定应该在应用rbcL序列鉴别的同时结合形态学以及其他分子标记技术进行综合分析。

3.1.2 黄褐毛忍冬：经rbcL序列分析，黄褐毛忍冬与红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬之间产生的变异碱基有8个，基于5种忍冬属药材rbcL序列生成的聚类图来看，忍冬和黄褐毛忍冬以57%（NJ）和81%（MP）的支持率聚为一支，其余种聚为一支，表明黄褐毛忍冬与山银花其余3个基原植物间差异明显。据李建军等[4]报道，黄褐毛忍冬萼筒呈倒卵状椭圆形，山银花其余种呈椭圆形；黄褐毛忍冬腺毛有两种类型，一种较长大，一种较多小，与其余山银花腺毛特征差异明显[1]。相关文献[12]报道，黄褐色毛忍冬生长适应性强，具有花多且大、产量较高、其化学成分和药理作用均与正品金银花相似，药理学研究也表明，黄褐毛忍冬总皂苷对实验性肝损伤具有保护作用[13]，同时黄褐毛忍冬是2010版《中国药典》新收录的山银花植物来源。鉴于以上现象，建议浙南地区引种黄褐毛忍冬，一方面增加浙南地区忍冬属药材多样性水平，另一方面可进一步研究黄褐毛忍冬药用价值，以缓解因金银花价格高、产量低、需求大等造成的市场压力。

3.2 金银花基原植物 传统的金银花原植物有多种，但2005版《中国药典》明确提出忍冬为金银花唯一植物来源，并规定木犀草苷成分为金银花的有效成分，与山银花进行了区别。为此，金银花与山银花的鉴别成为中药材行业的热点。有学者通过形态学差异区别二者，金银花的直径大于山银花；颜色呈淡黄色，而山银花颜色呈黄棕色或红棕色；金银花显微结构显示其单细胞非腺毛有两种，一种为厚壁，一种为薄壁，而山银花均为厚壁非腺毛[4]。熊艳等[14]利用HPLC指纹图谱对金银花和山银花进行了研究，发现二者成分的相对含量存在明显差别。本实验所测得的金银花及山银花rbcL序列表明，忍冬与红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬之间变异碱基9个，与黄褐毛忍冬间变异碱基5个，这从DNA水平揭示了金银花与山银花之间的差异，MP以及NJ聚类图表明忍冬与山银花原植物黄褐毛忍冬亲缘关系较近，与其余种亲缘关系较远。有文献[12]报道，黄褐色毛忍冬化学成分和药理作用均与正品金银花相似，这一结论在本实验聚类图中也得到印证。

3.3 rbcL序列分析在本实验中的意义 由于叶绿体rbcL基因是其遗传物质DNA的一部分，在忍冬属植物中具稳定性，不随季节的改变而变化，因此rbcL基因序列差别作为鉴别忍冬属药材提供了可靠的分子标记。在本实验中，rbcL能够从DNA水平区别金银花与山银花药材基原植物，为金银花与山银花的鉴别以及忍冬属植物系统发育提供了重要分子学依据。但由于叶绿体序列的高度保守性及本实验采样的局限性，利用rbcL序列将5种忍冬属药材精确鉴别尚需要结合其他分子标记及更全面的采样进行深入分析。

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RbcL sequence analysis ofLonicerain the South of Zhejiang province

LI Xiaoxia*，TAO Zhengming，WU Zhigang，LIN Xinchun，FAN Chuanyin.
*Institute of Subtropical Crop in Zhejiang Province，Wenzhou，325005.School of Pharmacy，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325005

Objective:To identify differentLonicerain the South of Zhejiang province by ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase large(rbcL)gene analysis.Methods:The primers designed by Primer Premier 5.0 to amplify the rbcL. ClustalX sequenced the rbcL gene. MEGA computed the value of transitional pairs and transversional pairs. The system diagram of genetic relationship was constructed by Neighbor-Joining and Maximun Parsimony， the out-group wasHeptacodium miconioides. Bootstrap evaluated reliability of diagram.Results:1143～1167 bp nucleotide were sequenced in rbcL fromLonicraplant，and remaining 1137 bp after revision，the conserved site，varible site and Parsim-Information site were 1126 bp，11 bp and 6 bp respectively. The value of the transitional pairs and transversional pairs was 3 and 2. The Si/Sv was 1.6. Both NJ and MP could divideLonicerainto two groups，one was theLonicerajaponicaandLonicera fulvotomentosa，the other was theLonicera macranthiodes，LonicerahypoglaucaandLonicera confusa.Conclusion:The rbcl gene plays an important role in identifing the differentLoniceraplant.

Lonicera；rbcL；sequence analysis；cluter analysis

R282.12

A

1000-2138（2012）06-0549-04

2012-06-18

李小侠（1986-），女，陕西宝鸡人，硕士生。

陶正明，副研究员，Email:zmtao2002@yahoo.com.cn。

丁敏娇）

·论 著·