一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法

张 哲，赵曙光，倪 阵，刘震雄，唐 华，李慧艳，闻勤生

第四军医大学唐都医院消化内科，陕西西安 710038

一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法

张 哲，赵曙光，倪 阵，刘震雄，唐 华，李慧艳，闻勤生

第四军医大学唐都医院消化内科，陕西西安 710038

目的观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞(KCs)分离方法获取KCs的效果。方法参照Akira提供的方法进行以下改进:①前灌注液在体灌注，Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;②Percoll分离液不连续密度梯度离心;③ 台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞。结果肝脏KCs的获得量为(3±1.5)×105/g鼠肝，细胞活度＞92%;光镜下细胞呈圆形，培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力，DAB染色呈“煎蛋”样，荧光显微镜下＞99%为KCs。结论改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs，简捷经济，值得推广。

Kupffer细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定

肝脏细胞包括实质细胞和非实质细胞，非实质细胞约占肝脏细胞总数的10%，其中肝脏巨噬细胞(kupffer cells，KCs)的比例约为33%。肝脏KCs是机体单核巨噬细胞系统主要组成部分，约占全身单核巨噬细胞总量的80% ～90%，代表着90%以上的功能［1-4］，在机体固有免疫中发挥重要作用。在病理条件下，KCs可被内毒素等激活释放炎性因子，参与肝癌、自身免疫性肝病以及非酒精性脂肪性肝病等的发生［5-9］。因此，研究KCs的功能对阐明KCs相关疾病的发病机制有重要作用，但KCs的分离培养相对比较困难，在一定程度上阻碍了对于KCs相关疾病的研究。目前，国外分离KCs应用较多的方法有离心淘析法、流式细胞术及免疫磁珠等，由于设备昂贵难于在我国推广。本实验参照Alpini等［10-11］提供的大鼠肝脏KCs分离方法并加以改进，观察对获取KCs效果的影响，为KCs相关疾病的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，清洁级，体质量(300±50)g由第四军医大学实验动物中心提供。普通饲料自由进食，实验前禁食12 h，不禁水。

1.2 实验试剂 PBS缓冲液购自西安沃林森生物技术有限公司;无水CaCl2(分析纯)购自天津市光复精细化工研究所;Ⅳ型胶原酶购自美国Sigma公司;Percoll细胞分离液购自美国Sigma公司;RPMI 1 640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司;青链霉素混合液购自德国Hyclone公司;兔抗大鼠CD163多克隆抗体购自美国 Santa Cruz Biotechnology公司;二抗FITC标记的山羊抗兔多克隆抗体和山羊血清封闭工作液均购自北京中衫金桥生物技术有限公司;DAPI染色液购自江苏碧云天生物技术研究所;DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;戊巴比妥钠(分析纯)购自北京化学试剂厂。

1.3 细胞分离液的配制 按照Alpini实验配制液体:(1)PBS:8 g NaCl、0.2 g KC、2.17 g Na2HPO4·7H2O、0.2 g KH2PO4，加去离子水定容至1 L，PH 为7.40，0.22 μm滤器过滤除菌。(2)前灌注液:青霉素:40 000 U，硫酸链霉素:0.02 g，肝素:500 U，加 PBS 液200 ml，调 PH值至7.40。(3)Ⅳ型胶原酶液:CaCl20.014 g、Ⅳ型胶原酶0.025 g，加 PBS 液 100 mL，调 PH 值至 7.40，青霉素:40 000 U，硫酸链霉素:0.02 g。(4)Percoll分离液:100%Percoll分离液，9∶1(9 mL Percoll+1 mL 10×PBS);50%Percoll分离液，10 mL 100%Percoll+10 mL 1×PBS;25%Percoll分离液，5 mL 100%Percoll+15 mL 1×PBS。(5)完全RPMI 1 640细胞培养液:RPMI 1 640培养基与胎牛血清以9∶1的比例配制，每1 mL RPMI 1 640细胞培养液加1 μL青链霉素混合液。

1.4 KCs的分离 (1)动物准备:取雄性S D大鼠1只，称重，麻醉。(2)无菌手术:依次消毒、开腹，充分暴露门静脉和下腔静脉，分离二者，剪破门静脉，24 G留置针插管，固定结扎。(3)肝脏灌注:灌注37℃预热前灌注液，剪开下腔静脉放血，灌速20 mL/min，待肝脏变黄白后，取下肝脏，转移至无菌平皿中;用37℃预热Ⅳ型胶原酶液以20 mL/min循环灌注，直至肝脏变软，肝包膜松弛塌陷，约10 min;剔除肝包膜及结缔组织并将其一同倒入烧杯后置 37℃水浴箱搅拌10 min;200目无菌滤网过滤细胞悬液后分装。(4)不连续密度梯度离心:将细胞悬液以70×g、4℃离心3 min，取上清;将上清以650×g、4℃离心7 min，弃上清，用10 mL PBS重悬沉淀，吹打均匀后缓慢移入含50%、25%Percoll分离液的离心管中，共3层(见图1A);以1 800×g、4℃缓升缓降离心15 min;离心后共4层 (见图1B);弃第1层，收集第2层和第3层，650×g、4℃离心7 min，弃上清，用5 mL的含10%胎牛血清的RPMI 1 640培养液重悬沉淀，吹打均匀。(5)细胞计数:吸取10 μL的细胞液和90 μL 0.4%台盼蓝充分混匀，取10 μL混合液加入细胞计数板计数。(6)细胞培养:以1×106/mL密度接种于 6孔板，置37℃、5%CO2孵箱内培养15～30 min后用PBS洗去未贴壁的非实质细胞;继续培养，正常显微镜下观察。

1.5 KCs的鉴定 (1)活力鉴定:取90 μL的细胞液和10 μL 0.4%台盼蓝充分混匀，光镜下观察。(2)细胞鉴定:①吞噬实验:培养24 h的KCs加入经高温消毒的碳素墨水，12 h后观察KCs吞噬功能。② DAB染色:将培养24 h KCs培养孔中的上清液吸净;干燥后加入2.5%的戊二醛，固定10 min，吹干;用PBS洗2次，3 min/次;0.05%DAB+0.03%H2O2混合后立即使用，室温下避光作用20 min后显微镜下观察。③细胞免疫荧光:培养24 h的KCs，爬片、固定、冲洗、封闭、加一抗(兔抗大鼠CD163多克隆抗体1∶1 000)、冲洗、加二抗(山羊抗兔多克隆抗体1∶500)、冲洗、DAPI、冲洗、荧光显微镜下观察。

图1 不连续密度梯度离心［4］ A:离心前;B:离心后Fig 1 Isopycnic(gradient)centrifugation with Percoll A:Before centrifugation;B:After centrifugation

2 结果

2.1 KCs的数量及活力 细胞获得量为 (3±1.5)×105/g鼠肝，台盼蓝鉴定细胞活度＞92%(见图2)。

2.2 细胞形态 未贴壁的KCs呈圆形，形态大小基本一致，悬浮于培养基中;15～30 min后，KCs贴壁呈扁圆形、变薄、边界模糊;继续培养，24 h观察细胞呈现典型的梭形及多角形，且生长状态良好(见图3)。

2.3 KCs的鉴定 ① 正常显微镜下:KCs胞浆内可见大量的黑色颗粒聚积(见图4);②DAB染色将KCs染为黄色，呈“煎蛋”样(见图5);③ 荧光显微镜下观察:绿色荧光为KCs胞膜，蓝色为KCs胞核，蓝绿色为双染KCs(见图6)。

3 讨论肝脏KCs是终

末期分化的单核巨噬细胞，主要存在于肝脏窦周间隙中，是肝脏抵御外来病原的第一道防线。在病理条件下可被内毒素、TNF等激活，释放TNF-α、IL-1、TGF-β 等炎性因子，这些炎性因子参与各种急慢性肝脏损伤的发生［5-9］。目前，国外多应用离心淘析法、流式细胞术及免疫磁珠法来分离KCs，但实验设备昂贵，不易在普通实验室推广。我们在对Froh等［4］的方法加以改进，成功分离出高纯度高活性的KCs。本方法高效、经济，有推广价值，在此详细介绍。

在分离KCs的过程中，我们发现影响KCs获取的因素有:① 大鼠体质量:大鼠体质量大小直接影响KCs的获得率，体质量较大的大鼠其肝脏相对较大，门静脉较粗，节省插管操作时间，减少了肝脏淤血及细胞污染的机会。②分离门静脉:门静脉周围结缔组织分离干净者，KCs获得率高。③ 肝脏灌注消化:避免灌注过程中气泡造成栓塞以影响消化效果;Ⅳ型胶原酶液的浓度文献中报道0.02% ～0.03%［12］，我们发现浓度为0.03%时消化效果最好;并严格参照Froh等［4］恒温(37℃)、恒速(20 ml/min)灌注。④ 温育:我们发现剔除肝脏包膜后的细胞悬液中有较多细胞团块，为了提高消化效果，我们在Froh等［4］的方法上加以改进，将剔除肝包膜及结缔组织后的细胞混悬液置37℃水浴箱中搅拌10 min，这样有利于细胞散开。⑤ Pronase E:Pronase E消化法国内外文献也有报道，但有实验证实［13］Pronase E在破坏肝细胞的同时也会破坏KCs表面的抗原CD14，而CD14又是低浓度脂多糖激活巨噬细胞的一种关键受体。因此，此法所得的KCs不能完全反映其功能。目前文献中尚无报道Ⅳ型胶原酶影响KCs的功能，本实验用Ⅳ型胶原酶进行灌注消化，取得了较好的效果。

KCs的鉴定:①吞墨功能实验研究既往较多地运用Latex颗粒，我们在实验中以价格便宜的高温消毒的碳素墨水代替价格较贵的Latex颗粒观察KCs的吞噬活性，取得了同样的效果。② DAB染色:DAB试剂性质不稳定见光易分解，在操作中一定要避光。③细胞免疫荧光:参照Alric等［14］的研究，本实验应用细胞免疫荧光法鉴定细胞更直观。

总之，目前国外分离肝脏非实质细胞的方法有离心淘析法［15］、流式细胞术［16］、免疫磁珠法［17］及密度梯度离心法［10-11］等。因离心淘析法、流式细胞术、免疫磁珠法等设备昂贵，难于在一般实验室推广。本实验在Froh等［4］密度梯度离心法基础上加以改进，与前几种方法比较，本实验方法获取KCs活度及纯度较高，且方法简捷经济，不需要特殊设备，便于普遍推广利用，为从细胞水平研究KCs相关疾病的作用奠定了基础。

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An improved method for isolation rat liver Kupffer cells

ZHANG Zhe，ZHAO Shuguang，NI Zhen，LIU Zhenxiong，TANG Hua，LI Huiyan，WEN qinsheng
Department of Gastroenterology，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an 710038，China

ObjectiveTo observe the isolation effect of kupffer cells(KCs)by an improved isolation method of KCs from a single rat liver.MethodsThe isolation method was based on Akira’s method with some improvements as followed:① After primarily perfused in vivo，the liver was perfused with collagens typeⅣ and digested in vitro;② Discontinuous density gradient centrifugation in Percoll was used;③The viability of isolated cells were determined by trypan blue staining;④ The purification of isolated cells by selective cell adherence;⑤ Phagocytosis test，DAB dyeing and CD163 immunofluorescence staining were used to identified isolated KCs.ResultsThe number of acquired cells was(3±1.5)×105per gram rat liver，and the viability of cells was more than 92%.The morphology of cells was roundness，and became spindle or polygonal after 24 h cultured.The cell had strong phagotrophic ability，and appeared“fried eggs”by DAB dyeing.More than 99%cells were identified as KCs by immunofluorescence staining.ConclusionThe improved isolation method of KCs is more productive of high purity of KCs，it is simple and economic.

Kupffer cell;Cell isolation;Primary culture;Cell identification

R575.5

A

1006-5709(2012)11-1060-05

2012-05-20

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.021

国家自然科学基金资助项目(No:81170376);陕西省中医药管理局科研项目(No:2009jc53)

张哲，硕士在读。E-mail:zhangyinhan_86@126.com

赵曙光，博士，主治医师。E-mail:zsg1203@126.com;闻勤生，教授，主任医师，硕士生导师。E-mail:wenqsss@yahoo.com.cn.