汾酒酒醅有机酸的研究及酿造工艺的优化*

刘坚，林汲，雷振河，吕利华，赵良启

1(山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原，030006)2(山西三盟实业发展有限公司，山西太原，030032)3(山西杏花村汾酒集团有限责任公司，山西汾阳，032205)

汾酒作为清香型白酒的代表，以其优良品质驰名中外，经久不衰［1］。汾酒生产是以汾酒大曲特定微生物群落做为生物作用剂，群落结构菌群依次消长、顺序代谢完成酿造，因此环境因素和操作条件对酒醅发酵的影响很大。在实际生产中，一个突出的问题是夏季酒醅总酸度常常偏高，影响了酒的品质和出酒率，造成经济效益下降。不仅汾酒生产如此，全国白酒行业也普遍存在这个共性问题，亟需解决［2］。

本研究通过HPLC分析了夏季酒醅中有机酸的组成，采用平板划线法分离得到了正常酒醅和酸度过高酒醅中的产乙酸细菌和产乳酸细菌。考察环境温度、入缸水分和装料量等对出缸酒醅总酸度的影响，最后通过响应面试验对汾酒酿造过程进行优化，获得优质汾酒的最佳酿造条件，为汾酒“自动化控制，机械化生产”提供理论依据［3］。

1 材料和方法

1.1 原料和仪器

高粱(705)、大曲、夏季正常酒醅和酸度过高酒醅，汾酒厂提供;2L的陶瓷罐;分析纯标准品:丙酸、草酸、丙酮酸、甲酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、戊二酸;优级纯硫酸、超纯水。

主要仪器:2487型双波长检测器(Waters公司)、PRP-X 300 离子排斥色谱柱(7 μm，250 mm ×4.6 mm)。

1.2 试验方法

1.2.1 夏季酒醅中有机酸的测定

1.2.1.1 有机酸标准液和酒醅上样液的配制

分别按质量称取不同的有机酸标品，用去离子水定容至100 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤，稀释为不同浓度梯度的标准溶液。取20 g酒醅，用40 mL蒸馏水浸出(约30 min)其可溶性成分，普通滤纸减压抽滤后，10 000 r/min离心10 min，0.22 μm 滤膜过滤，得到上样液。

1.2.1.2 色谱条件

柱温:25℃;色谱柱:PRP－X 300离子排斥柱;检测:紫外双波长检测器210 nm;流动相:0.05 mmol/L硫酸溶液(0.22 μm醋酸纤维素滤膜过滤，超声波脱气 30 min);流速:1 mL/min;进样量:15 μL;在此色谱条件下上样，分别检测各有机酸的标准品和酒醅样品，以出峰时间定性，以峰面积定量。

1.2.2 产酸细菌的分离

1.2.2.1 培养基

乙酸细菌培养基:酵母膏10 g，葡萄糖100 g，Ca-CO320 g，琼脂 20 g，自来水 1 000 mL，制霉素 50 μg/mL，乙醇 1%，pH 6.8。

乳酸细菌培养基:蛋白胨10 g，酵母膏10 g，牛肉膏 10 g，葡萄糖10 g，番茄汁100 mL，CaCO32 g，吐温80 0.5 mL，琼脂 15 g，胡萝卜 40 g，溴甲酚绿0.1 mL，自来水 900 mL，制霉素 50 μg/mL，pH 6.5。

1.2.2.2 产酸菌的分离

分别称取正常和酸度过高酒醅10 g，溶于100 mL无菌水中摇匀，梯度稀释，涂布于乙酸菌培养基和乳酸菌培养基上，每个梯度涂布3个。将涂布好的平皿按产乙酸细菌好氧培养和产乳酸细菌厌氧培养，培养时间依菌落生长状况而定(3～7 d)，最后进行计数，分别算出正常和酸度过高酒醅中的醋酸菌和乳酸菌数。

1.2.3 影响酒醅总酸度条件试验

1.2.3.1 酒醅出缸总酸度测定方法

称取200 g酒醅加入200 mL蒸馏水，搅拌30 min后静置10 min，取其液体50 g置于250 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，充分振荡后抽滤(抽滤后液体透明，不影响后面滴定时颜色变化)，取过滤液30 mL于烧杯中用0.1 mol/L NaOH进行酸度滴定，重复滴定3次，取平均值N(单位:mL)用于酸度的计算。酸度定义:1 g酒醅消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH，即为1个酸度，单位(0.1 mol NaOH mL/g酒醅)。酸度计算公式:

1.2.3.2 影响酒总醅酸度条件的摸索

(1)入缸温度试验:酒醅分别在30～40℃、20～30℃和10～20℃之间入缸。(2)发酵环境温度试验:酒醅入缸后分别置于20、25和30℃下发酵。(3)入缸水分试验:以43%、53%和63%的酒醅入缸水分进行发酵。(4)大曲加量试验:酒醅入缸时大曲加量分别为5%、10%和20%进行发酵。(5)入缸装料量试验:酒醅在入缸时分别按每缸装0.4 kg(2L的陶瓷罐，下同)、0.65 kg和0.9 kg进行发酵。以上各试验均平行做3缸且只改变1个因素，其他因素按汾酒操作工艺执行，发酵完成测定其总酸度，算出平均酸度。

1.2.4 汾酒酿造工艺的响应面优化试验

在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken的中心组合原理进行三因素三水平实验。三因素分别为发酵的环境温度、入缸水分和每缸装料量(简称:装料量)。响应面试验设计的试验因素和水平见表1。

表1 试验因素设计表

2 结果与分析

2.1 夏季酒醅中有机酸的测定

有机酸标准品进行HPLC检测，确定有机酸标品的保留时间、回归方程和相关系数，结果见表2。

表2 有机酸标品的保留时间、回归方程及相关系数

对酒醅上样液进行检测，共检测到7种有机酸，依出峰顺序分别为:草酸(0.016 g/100g酒醅，单位下同)、丙酮酸(0.12)、甲酸(0.054)、柠檬酸(0.032)、乳酸(0.5)、乙酸(0.385)和琥珀酸(0.049)(见图1)。由此可知，酒醅中有机酸以乙酸和乳酸含量最多。

图1 夏季酒醅HPLC分析图谱

2.2 产酸菌的分离结果

以溴甲酚绿为指标剂，根据变色情况挑选产酸细菌;在醋酸菌培养基上，以乙醇为胁迫条件，筛选产乙酸细菌。从正常酒醅中分离到23株产乙酸细菌，5株产乳酸细菌;从酸度过高酒醅中分离到产乙酸菌22株，产乳酸菌29株。表明，正常和酸度过高酒醅中乙酸菌的含量大致相同，而酸度过高酒醅中乳酸菌的含量显著高于正常酒醅，这也证明了课题组前期的研究结果:酒醅总酸度过高是乳酸造成的［4］。

2.3 影响酒醅总酸度条件试验结果

2.3.1 入缸温度试验

酒醅平均酸度分别为3.63(10～20℃)、3.68(20～30℃)和3.65(30～40℃)，可知酒醅的入缸温度对酒醅的出缸酸度基本没有影响。

2.3.2 发酵的环境温度试验

酒醅平均酸度分别为3.17(20℃)、3.63(25℃)和3.96(30℃)。由此可知，环境温度对酒醅的出缸总酸度有较大的影响(图2)。

图2 酒醅发酵环境温度试验结果

2.3.3 酒醅入缸水分试验

酒醅平均酸度分别为3.52(43%)、3.63(53%)和5.37(63%)。由此可知，酒醅的入缸水分对酒醅出缸酸度有明显的影响(见图3)。

图3 酒醅入缸水分试验结果

2.3.4 酒醅入缸时大曲加量试验

酒醅平均酸度分别为3.6(5%)、3.63(10%)和3.61(20%)。由此可知，大曲加量对酒醅出缸总酸度没有明显的影响。

2.3.5 酒醅入缸时装料量试验

酒醅平均酸度分别为4.47(0.4 kg)、3.9(0.65 kg)和2.76(0.9 kg)。由此可知，每缸装料量对酒醅的出缸酸度有显著的影响(见图4)。

图4 酒醅入缸时装料量试验结果

由此可知，入缸温度和大曲加量的变化对酒醅出缸总酸度的影响不大，但发酵的环境温度、入缸水分和每缸装料量对酒醅出缸总酸度有较大的影响。

2.4 汾酒酿造工艺优化结果

2.4.1 响应面试验结果

环境温度、入缸水分和装料量对酒醅出缸总酸度的响应面实验结果见表3。

表3 响应面试验设计和结果

2.4.2 响应面模型分析

以酒醅的总酸度做为响应值，采用Design-Expert7.1.6对试验结果(见表3)进行回归分析，得到方差分析结果(见表4)和二次回归方程为:

由表4可知，环境温度、入缸水分和装料量对酒醅的出缸总酸度的影响达到极显著水平(P＜0.01)，表明三因素对酒醅出缸总酸度线性效应极显著。所有二次项都达到显著水平(P＜0.05)，说明三因素对酒醅的出缸总酸度的影响有显著的交互作用，其中AB和BC项之间的交互作用还达到了极显著的水平(P＜0.01)。从表4中还可知此模型的P＜0.01，说明该二次方程达到极显著水平，并且失拟项为0.660 3，远大于0.05，不显著，所以该方程能够很好的解释各因素与相应值之间的真实情况。

2.4.3 三维响应面图谱

由于二次项均达到显著水平，所以各因素对出缸酸度不是简单的线性关系，根据Design-Expert软件做出响应面图。

表4 方差分析结果

由图5～图7可知，酒醅的出缸总酸度随着环境温度的增大而变大，入缸水分在51%左右时酒醅的总酸度最小，加大或减小入缸水分都会使出缸酒醅总酸度升高，而随着装料量的增加酒醅的出缸总酸度会降低。经模型软件分析最终得到汾酒酿造的最佳酒醅出缸总酸度条件是:环境温度为19.33℃、入缸水分为51.28%、每缸装料量为0.83 kg，出缸酒醅的总酸度为2.07。

图5 环境温度与入缸水分交互作用图

图6 环境温度与加料量交互作用图

2.4.4 优化工艺验证实验

图7 入缸水分和加料量的交互作用图

为了证实试验结果的可靠性，以最佳酒醅出缸酸度条件修正值(以便于操作)，即环境温度20℃，入缸水分51%，每缸装料量0.83 kg，进行了3组汾酒酿造验证实验，最后酒醅的出缸平均酸度为2.12，与预测值相近，试验优化的模型可靠。

3 讨论

通过HPLC检测，发现酒醅中共有7种有机酸，其中乙酸和乳酸的含量最多，通过平板划线法分别筛出正常和酸度过高酒醅中的产乙酸菌和产乳酸菌，酸度过高酒醅中的乳酸菌含量明显高于正常酒醅，这更证实了引起酒醅总酸度较高的原因是乳酸菌的不正常代谢［5］。

基于汾酒的酿造，是以特定的生物作用剂(大曲或小曲)作为发酵剂，即通过特定结构的微生物群落的依次生长和顺序代谢完成酿造过程。因此，通过调节环境因素和操作条件控制功能菌的消长次序和代谢方向就显得十分重要。环境温度的高低会影响酒醅温度的变化，酒醅温度过高会不利于产酒酵母生长和乙醇合成，而有利于产酸细菌的生长和有机酸过量合成。入缸水分过高，会使酒醅中的氧气减少，更有利于乳酸菌生长，会使酒醅中乳酸过高;而入缸水分过低，会加大酒醅中的氧气含量，促进好氧乙酸菌的生长与代谢，导致酒醅中乙酸浓度增加，这就是入缸水分过高或过低均会使酒醅酸度增加的原因。入缸装料量与酒醅酸度的关系也可用调节氧气浓度，控制好氧产酸菌生长与代谢的机理来解释。

4 结论

通过响应面法试验，发现环境温度20℃，入缸水分51%，装料量0.83 kg，为最佳优化条件，此条件下，出缸平均总酸度为2.12。本研究揭示了汾酒酿造过程中导致酒醅酸度过高的内在原因，通过改变酿造工艺达到了降酸保醅的目的［6］，为提高汾酒的质量和产量提供技术参数，进而为汾酒厂实现“自动化控制，机械化生产”奠定了一定基础。然而若将此工艺用于汾酒的生产实践还需进行放大试验研究。

［1］ 熊子书.中国三大香型白酒的研究(三)清香·杏花村篇［J］．酿酒科技，2005(7):17－21.

［2］ 陈俊平.谈清香型大曲酒生产如何创新控酸保醅［J］．酿酒，2009，36(5):30 －31.

［3］ 佟晓群.中国白酒158计划正式启动［N］．中国食品报，2011－05.

［4］ 赵佳，雷振河，吕利华，等.汾酒产酸细菌的分离鉴定及其产酸条件研究［J］．食品与发酵工，2009，35(12):42－46.

［5］ 王牛牛，雷振河，吕利华，等.以红曲霉酯化酶催化合成乳酸乙酯［J］．食品与发酵工业，2011，37(1):73－77.

［6］ 李增胜.提高汾酒质量和产量的探讨［J］．酿酒科技，2005(4):104－105.