发酵促进剂在三孢布拉霉生产番茄红素中的应用*

师艳秋，辛秀兰，袁其朋

1(北京化工大学生命科学与技术学院，北京，100029)2(北京电子科技职业学院生物技术系，北京，100029)

番茄红素是一种重要的脂溶性类胡萝卜素，具有很强抗氧化、清除自由基、抗癌抑癌、增强机体免疫、延缓衰老和预防心血管疾病等重要的生理功能［1］，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。它的生产方法主要有3种:天然植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法以天然植物为原料，经有机溶剂提取或超临界萃取制取类胡萝卜素，但由于原料含量太低，生产成本居高不下［2］。化学合成法可商业生产β-胡萝卜素和番茄红素等类胡萝卜素，虽然生产成本低，但产品吸收率较低，而且人们对化学合成品毒副作用的担心，限制了其市场的发展［3］。微生物发酵法与天然植物提取法和化学合成法相比，具有产量高、成本低、产品无毒副作用、体内吸收率高等优点，是目前番茄红素生产的主要方法［3］。毛霉目真菌三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)是世界上最常用的β-胡萝卜素高产菌株。根据Blakeslea trispora的代谢途径，若在发酵过程中添加合适的阻断剂，阻断番茄红素到β-胡萝卜素的代谢途径，就可以促进番茄红素的积累［4］。可由Blakeslea trispora生产的番茄红素已被联合国粮农组织(FAO)、食品添加剂委员会(JECFA)和世界卫生组织(WHO)认定为A类营养素，并被50多个国家和地区作为具有营养与着色双重作用的食品添加剂，广泛应用于食品、医药和化妆品领域［5］，在欧美保健食品市场上供不应求。因此，用微生物发酵生产番茄红素的研究也日益受到重视。

选育构建高产菌种及优化发酵条件，是利用生物技术生产类胡萝卜素不可缺少的两个方面(内外因关系)。研究和实践表明，在已确定碳源、氮源及其用量等的基本培养基中，添加某些发酵促进剂对于促进发酵和增产往往具有事半功倍的效果［6］。

为此，笔者结合本实验室承担的提高番茄红素发酵水平及其发酵机理研究课题所作的部分工作，结合国内外发酵促进剂作用于番茄红素生产的研究现状，对三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素中添加的各种促进剂及对番茄红素生产的影响进行了综述，并依据作用机制的不同，进行了系统地归类总结。

1 性激素——三孢酸以及结构类似物

三孢酸是Blakelea Trispora(+)和(-)菌混合培养时产生的关键代谢产物，为Blakelea trispora、Phycomyces blakesleanus和Mucedo等毛曲霉目的性激素，对提高类胡卜素的合成能力有重要的作用。究其原因就是混合培养时，属于有性繁殖，来源不同的“+”、“－”菌的菌丝体互相接触，发生原生质和细胞核的结合，生成接合孢子，最后减数分裂形成单倍的营养体——三孢酸。发酵培养阶段，在三孢酸刺激作用下，菌体合成大量类胡萝卜素，从而提高了发酵产率。已有的研究结果也证实了它的促进作用，在利用Blakelea trispora发酵生产番茄红素的过程中添加外源性的三孢酸，其发酵水平可提高2～15倍［7］。

不但三孢酸具有促进类胡萝卜素生产的作用，就是 α-紫罗酮、β-紫罗酮、VA、脱落酸、异烟肼、琥珀酰亚胺、柠檬油萜烯和芳香族化合物的结构类似物也有此性质，它们的加入均能提高类胡萝卜素的产量，从而提高番茄红素的产量［8］。通过三孢酸结构类似物结构式的分析，可以确定当化合物必须具备1个环状结构并带1个酮基和1个的侧链结构才具有这种生物活性。

2 抗氧化剂

番茄红素易于氧化，因而在发酵过程中添加抗氧化剂会防止番茄红素的氧化，从而提高产量。秦敬改［9］在研究抗氧化剂BHT对三孢布拉霉发酵生产类胡萝卜素时发现，当添加1g/L的BHT时类胡萝卜素产量提高30%。刘海丽［10］添加0.025%的抗氧化剂Ethoxyquin，发现对类胡萝卜素产量的增长有显著作用，可使产量增加70%。

3 氧载体与表面活性剂

在发酵生产番茄红素中，三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，从发酵动力学方面去改善培养介质的性能，可以通过添加氧载体、表面活性剂［11］提高同一反应系统的传氧系数来提高番茄红素的产量。研究报道，添加非离子表面活性剂Span-20不仅可以改变三孢布拉霉菌发酵液流体特性和细胞通透性，而且更重要的是它是水溶性表面活性剂，形成的分散型菌丝体更加有利于细胞内外物质的传递并营造利于番茄红素合成的有利条件，因而可使番茄红素生产能力大幅度提高［12］。

朱艳［13］在发酵第1天的时候添加H2O2到发酵体系中，可以提高番茄红素的产量达到40%。在发酵刚开始分别加入1%的氧载体——正己烷、正十二烷，可使产量分别提高25%和72%。并且在添加氧载体的同时，进行了各种表面活性剂的添加实验，选取了 Span20、Tween20、Tween80和 Triton-x100为代表，进行了复合实验，番茄红素产量大幅提高，最高可提高114%，优于单一添加氧载体或表面活性剂。

王常玲［14］在发酵过程6h时，添加0.13%的表面活性剂大豆卵磷脂，番茄红素的产量达到最大值1.58 g/L，比对照提高了56.44%。刘淑惠［15］研究了发酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附气体的性质，增加发酵液中溶解氧的浓度，改善发酵液黏度，促进三孢布拉霉菌的生长，番茄红素的产量提高为原产量的150%以上。

4 前体物质

前体物质指某一代谢中间体的前一阶段的物质。例如葡萄糖是糖原或乳酸的前体物质;原叶绿素是叶绿素的前体物质;原维生素是维生素的前体物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。按惯例是不包括极简单的原料物质的。在生物合成番茄红素的过程中，初级代谢产物以及中间代谢产物都可以看作是番茄红素的前体物质。

三孢布拉霉生物合成番茄红素的途径复杂，但是已基本探明了番茄红素及相关类胡萝素的生物合成途径(图1)。已有的研究表明，初级代谢中间产物柠檬酸、乌头酸、苹果酸和琥珀酸对番茄红素的合成均有一定的促进作用，以柠檬酸的促进作用最为显著［16］。王常玲［17］在发酵 24h 添加 2.0% 的柠檬酸时，番茄红素的产量达到 0.99 g/L，比对照提高了39.43%。也有文献报道，添加柠檬酸盐和苹果酸盐可刺激三孢布拉霉菌体内类胡萝卜素的合成［18］。

5 激活代谢途径中的相关酶的活性的物质

5.1 青霉素

青霉素可以刺激MVA激酶的酶活(图1)，从而可以增加类胡萝卜素前体物质异戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，有利于代谢流向番茄红素合成转移［16］。解书怀［18］在发酵后第一天添加1 mg/L 的青霉素，番茄红素产量提高32%。

5.2 花生四烯酸(AA)

刘淑惠［15］在实验过程中发现，添加AA(花生四烯酸，类二十烷酸的前体，类二十烷酸是很多生化过程中的重要调节剂)，可以提高番茄红素产量，达到47%。添加依据是 Rodriguea-Concepcion等［19］使用AA处理过番茄后发现，HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶被认为是MVA途径中的第一个限速酶，是细胞质萜类化合物的代谢中的重要调控点)的活性提高了，并且促进了番茄红素的合成。毛霉目真菌番茄红素的代谢途径与植物体内合成番茄红素的代谢途径相似，并且存在相同功能的一套代谢酶系。因此可知，花生四烯酸刺激并提高了真菌三孢布拉氏霉中的HMGR的活性，促进了番茄红素的累积。

5.3 试剂A(HMG-CoA)

图1 真菌中类胡萝卜素的代谢途径

在类胡萝卜素生物合成途径中，HMG-CoA reductase催化HMG-CoA形成甲羟戊酸(MVA)，由于MVA的形成是一个不可逆过程，因此，HMG-CoA reductase被认为是动物、植物、真菌可能也是昆虫的类异戊二烯代谢途径的一个限速酶。许多研究者都报道，异戊二烯生物合成途径的诱导，尤其是倍半萜类物质的合成，与HMG-CoA reductase活性成正相关。在类胡萝卜素生物合成途径中(图1)，试剂A可使HMG-CoA reductase酶活增加2倍，从而可以增加类胡萝卜素前体物质异戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，提高番茄红素的产量。解书怀［18］在添加试剂A后，刺激三孢布拉霉类胡萝卜素合成代谢途径中试剂A代谢，使HMG-CoA reductase酶活提高两倍，实验结果表明:在发酵第1天添加0.05%的试剂A，可使番茄红素产量提高31%，最大达到1.49 g/L。

6 金属离子和盐

微生物在生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，而且这些离子的生物学作用各不相同。文献报道:三布拉霉菌两性株混合培养发酵时，添加微量(0.01 mol/L)铜离子、镁离子、铁离子可增加胡萝卜素合成的速率，并使得终产物的产量增加几倍。

Mg2+是物质代谢过程中许多酶的辅助因子或激活剂，参与酶促反应，激活酶活性，Mn2+对生物生长及次级代谢产物的生产具有较大的影响，而且Mn2+对番茄红素的稳定性影响不大，徐军伟［20］通过添加及改变培养基中的Mn2+、Mg2+量来考察微量元素对发酵的影响，结果如下:在发酵过程中添加Mn2+，菌体生物量和番茄红素的产率与对照试验相比都有较明显的提高。说明Mn2+对发酵有较大的影响。发酵液中当浓度较低时，能够促进菌体生长和番茄红素合成，但当Mg2+过高时，菌体生物量和番茄红素产率反倒降低，可能较高的Mg2+浓度对三抱布拉氏霉菌产生毒害作用，抑制菌体生长和产物合成。

7 番茄红素环化酶抑制剂

番茄红素环化酶是三孢布拉霉菌合成番茄红素到β-胡萝卜素所需的酶，生物法生产番茄红素的关键步骤就是添加番茄红素环化酶抑制剂，打断番茄红素至β-胡萝卜素的环化反应，使代谢流停留在番茄红素阶段。常见的番茄红素环化酶抑制剂有两类:一类为叔胺类化合物，主要包括对二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基-乙醇、2-二甲氨基-1-丙醇、1-二甲氨基-2-丙醇、3-二异丙基氨基-1-丙醇、1-二异丙基氨基-2-丙醇、三乙胺、2-二甲氨基乙苯等［21］;另一类是含氮类杂环化合物，如烟碱、咪唑、吡啶、吗啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物［22］。目前由于叔胺类化合物毒性较大，在微生物法生产番茄红素中较少应用。徐娜等［23］对不同阻断剂作用效果进行比较，发现咪唑、烟碱、N-甲基吗琳、吡啶及哌啶均可促进三孢布拉霉累积番茄红素，但前三者的效果优于吡啶及哌啶，发酵产物中β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素较少。考虑到工业生产成本，还考察了废弃烟渣水抽提物对此菌产生番茄红素的影响，结果表明在一定条件下，加入废弃烟渣水提物可使番茄红素的积累量从对照的1.42 mg/L增加到160.3 mg/L，具有良好的工业应用前景。

8 麦角固醇合成抑制剂

番茄红素和麦角固醇的合成前体都是法尼基二磷酸(FPP)，通过控制麦角固醇的合成，来达到积累番茄红素的目的(图1)。麦角固醇合成抑制剂——十二环吗啉、嗪氨灵、氟康唑、酮康唑 、盐酸特比萘芬等，抑制合成麦角固醇酶的活性，使得麦角固醇产量降低，使得三孢布拉氏霉的类胡萝卜素产量提高。孙颖［24］在发酵48h时添加0.7 mg/L的盐酸特比萘芬和30 mg/L的酮康唑，可使番茄红素的含量增加23%和277%。

9 结语

目前制约发酵法工业化生产番茄红素的主要因素是微生物不能高水平的积累番茄红素，导致发酵产率低、生产成本较高。番茄红素合成途径复杂，构建番茄红素基因工程高产菌至今尚未取得突破性进展。因此，筛选和寻求合适的发酵促进剂，对提高该菌生物合成β-胡萝卜素与番茄红素的能力，降低生产成本，增加大规模发酵生产番茄红素的技术可行性，将会有很大的实际意义。

综上所述，试验研究所用的发酵促进剂种类很多，大多数对番茄红素的发酵作用是肯定的，随着研究的不断深入，作用显著、使用方便的发酵促进剂将会在番茄红素生产中得到普遍应用。

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