HPLC法测定松针中原花青素的含量

2012-01-10严子军韦寿莲汪洪武邓清华

肇庆学院学报 2012年5期

严子军，韦寿莲，汪洪武，邓清华

（肇庆学院化学化工学院，广东肇庆 526061）

松针(pine needles)是松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物的叶，又名松叶、松毛等.全世界共有10个属230余种，我国松树有10个属120余种，可供药用和饲用的有13种[1].松针性温，味苦、涩，入心、脾经[2]，其主要功效为驱风活血、明目、安神、解毒、燥湿止痒.可治疗风湿性关节炎、跌打肿痛、夜盲症、高血压、神经衰弱、浮肿、湿疮疥癣等，并能防治流行性感冒、流行性脑炎、钩虫病等[3].松针中含有挥发油类、粗蛋白、氨基酸、色素、维生素、多元酚类等多种化合物[4].原花青素是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物，其基本组成为黄烷－3－醇和黄烷－3,4－二醇.原花青素是清除自由基很强的抗氧化剂，其抗氧化、清除自由基的能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍.目前，原花青素已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域.采用高效液相色谱法测定爬山虎、葡萄籽和玫瑰花提取物中原花青素含量的研究已有报道.而国内对松针提取物中原花青素含量测定方面的研究报道极少，更未见采用高效液相色谱法测定松针中原花青素含量的相关报道.

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

实验所用材料和试剂如下：松针（采自肇庆北岭山）；AB－8弱极性大孔吸附树脂（上海润捷化学试剂有限公司）；质量分数为95%的乙醇（A.R.，天津市广成化学试剂有限公司）；石油醚（A.R.，天津市广成化学试剂有限公司）；浓盐酸、氢氧化钠（A.R.，汕头市西陇化工厂有限公司）；甲醇、乙腈(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)；原花青素对照品（贵州迪大科技有限责任公司，纯度≥99%）.

1.2 实验仪器

实验所用仪器如下：高效液相色谱仪Agilent 1200；G1314B VWD紫外检测仪；色谱柱为Zorbax Eclipse XDB－C18(4.6mm×150mm，5μm)；GKC210R 4型可控恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；800型低速离心沉淀机（深圳市沙头角南国华仪器厂）.

1.3 松针中原花青素的提取

将干燥松针剪切后用粉碎机粉碎，过筛(孔径为1.25mm，粒径≤1.5mm)，采用石油醚脱脂[5]，晾干备用.称取20.00 g脱脂松针粉进行超声波辅助提取.提取液是质量分数为60%的乙醇(料液比1:10)，温度为40℃，pH值为4，提取时间为45m in.连续提取3次，合并提取液并过滤，将温度控制在45℃下旋转蒸发浓缩，备用.

大孔吸附树脂预处理：按文献[6]的方法预处理、平衡树脂柱.上样：树脂柱平衡后，将松针提取液以1m L/m in的流速上样.

淋洗：用20m L蒸馏水以1m L/m in的流速冲洗去除未被吸附的原花青素及小分子杂质.洗脱：用质量分数为75%的乙醇以1.5m L/m in的流速洗脱，收集洗脱液80m L，备用.

1.4 供试溶液制备

精密量取纯化后的松针提取液1m L置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后再稀释10倍，备用.

1.5 对照品贮备液

精密称取原花青素对照品5.0mg，置于5m L的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1.0 mg/m L的溶液，备用.

1.6 实验方法

色谱柱为Zorbax Eclipse XDB－C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为甲醇－乙腈－水＝75:20:5；流速为0.6m L/m in；检测波长为280 nm；进样量为20μL.

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

天然产物提取物中含有复杂的成分，采用HPLC分析时要对其流动相进行优化.尝试以甲醇:水(V: V＝90:10)为流动相分离松针提取液，发现色谱峰重叠并伴随拖尾现象.以甲醇:乙腈(V:V＝70:30)为流动相分离松针提取液，色谱峰没有拖尾现象，但未能达到完全分离.实验发现在流动相中加入少量的水有助于提高分离度，以甲醇:乙腈:水(V:V:V＝75:20:5)为流动相分离松针提取液，所得的色谱峰尖锐，分离效率高(见图1).色谱峰经加标确认，3.105m in所对应的色谱峰为原花青素.

图1 对照品（A）和松针提取液（B）的HPLC色谱图

2.2 线性范围

精密量取对照品贮备液1m L，置于5m L容量瓶，定容至刻度，再依次稀释成不同浓度，分别进行色谱分离分析.以浓度（mg/m L）作为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.原花青素的线性回归方程为y＝6 398.1x－5.492 2，R2＝0.997 5，原花青素在0.01～0.20mg/m L内呈现良好的线性关系.