云南省家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突变的研究

武治国 陈明清

大肠癌是世界上高发恶性肿瘤之一,欧美国家大肠癌的发病率排在恶性肿瘤的第2位,在中国为第4～6位,近年更有上升趋势[1]。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)和遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancers,HNPCC)是遗传性大肠癌的2种主要类型，其中FAP典型的临床表现为患病者从青春期开始结直肠黏膜出现弥漫性腺瘤性息肉，如不进行及时恰当的医学干预，将在30岁左右发展成为结直肠癌，是导致FAP患者死亡的第一位原因[2～4]。目前临床上，FAP患者的确诊多数依赖纤维结肠镜的检查，但发现时一般较晚，无法提供早期诊断。随着医学的发展，FAP相关致病基因突变筛查可以提供临床前期诊断，有助于早期预防及治疗。近年来，云南地区大肠癌发病率成上升趋势[5]，且云南人群FAP相关致病基因研究鲜见报道，本研究针对云南省FAP患者相关致病基因APC基因胚系突变，初步探讨该地区FAP患者致病基因突变特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

10个FAP家系先证者(汉族7例，彝族2例，白族1例)分别来自云南省昆明市、昭通市、大理州、红河州，均经手术和(或)家族史证实为FAP(或伴癌变)患者。经患者同意后由其介绍和引导其直系和旁系各级亲属进行遗传学咨询，并以先证者为中心绘制3代以上家系图谱(图1)。

图1 云南省10个FAP家系图谱

1.2 基因突变检测方法

1.2.1 DNA提取 获取书面知情同意书后，抽取10名先证者及其家系成员外周静脉血各5 ml，以0.5 mmol/L 1 ml的EDTA抗凝。应用QIAamp DNA抽提试剂盒(Qiagen，Germany)按照试剂盒说明书提取DNA，应用分光光度法测定DNA浓度及纯度，-20℃冰箱冷藏备用。

1.2.2 引物设计 参照文献[6]设计APC基因各外显子的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物共35对，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应在MyCycler PCR仪(Bio-RaD，USA)上进行，反应总体积为30 μL∶100 ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，2.5 mM MgCl2,10 mM dNTP，正向和反向引物各3.3 μM，1U Taq DNA聚合酶。反应条件参照文献结合预实验稍加调整:95℃预变性5 min(1个循环)；95℃变性30 s，57℃～61℃退火(根据预实验各引物退火温度)30 s，72℃延伸30 s(35个循环)；72℃最终延伸10 min (1个循环)。

1.2.4 DNA测序 PCR扩增产物纯化后上ABI PRISMTM-3730XL DNA测序仪 (Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)进行双向DNA测序，测序引物与PCR引物相同，测序试剂为BigDyeRTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit。

1.2.5 测序分析 应用Chromas 2.3软件分析测序结果，参考美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上APC基因序列(NM-000038)，进行序列比对。

2 结果

2.1 DNA提取结果

应用分光光度法测定DNA浓度：40～100 ng/μL；纯度：OD260/OD280=1.6～1.8。

2.2 PCR扩增效果

2%琼脂凝胶电泳结果显示，APC基因15个外显子均得到成功扩增，PCR反应产物均为单一区带，大小与预计扩增一致。

2.3 DNA测序结果

2.3.1 APC基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 对10个FAP家系先证者APC基因全编码区行突变检测，检出汉族J家系先证者APC基因发生无义突变，其他的6个汉族和3个少数民族家系中未发现APC基因致病性突变，仅检测出SNP,包括Y486Y、T1493T、G1678G、D1822V、S1756S、P1960P。经http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp网站上SNP数据查对，为正常人群中常见突变，均属于SNP，考虑为非致病突变。

2.3.2 APC基因致病性突变 汉族J家系先证者APC基因检测出无义突变(图2)，因APC基因上核苷酸3587C>A，导致15外显子密码子1196从编码丝氨酸(Ser)变为终止密码子(S1196X)，因终止密码子提前出现，从而使APC蛋白呈截短改变。经APC基因突变数据库(http：//www.umd.be/APC和http://www.china-hvp.org/LOVD/home.php?%20select_db=APC)查对，国外有此突变报道，但国内尚未见此突变的相关报道。此外，该家系还检出位于15外显子T1493T、G1678G、D1822V、P1960P的突变，属于SNP，考虑为非致病突变。

图2 家族性腺瘤性息肉病患者J家系APC基因测序图箭头表示在此点为单核苷酸突变APC基因c.3587C>A

根据J家系先证者APC基因核苷酸3587C>A这一突变位点，筛查该家系其他8名成员，7人检出此突变(图1-J家系)，并经结直肠镜检查证实，成员Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4均发现结直肠数百个息肉；成员Ⅲ2、Ⅲ3分别为18和16岁，在降结肠和直肠部位可见十几个息肉；Ⅲ4仅12岁，肠镜未检查出息肉，为基因突变携带者；成员Ⅲ1未携带这一突变，镜下未见息肉。Ⅰ2于1991年在当地医院行全结肠切除术，Ⅱ2在昆明医学院第一附属医院接受预防性全结肠切除手术。

3 讨论

3.1 FAP家系进行致病基因检测的意义及方法

FAP是1种常染色体显性遗传病，位于5q21的APC基因突变是其发生的分子遗传学基础。自1986年Herrera首次报道APC基因后，此基因的结构及功能被认识的越来越深入，其编码的APC蛋白有多个功能区域，直接参与Wnt信号传导途径，并在细胞-细胞间黏附、细胞骨架的微管稳定、细胞周期的调节、细胞凋亡中发挥作用[7]，到目前为止，已发现APC基因致病突变超过700多种[8]。此次研究的10个家系，均进行了至少3代的家系调查，其中D家系和G家系中的患者无明确的家族史，考虑是新发患者，与文献报道20%的FAP病例无家族史相一致[9]。无论是新发FAP患者还是有家族史的FAP患者，都符合孟德尔遗传定律，他们的子代都有50%的可能通过遗传而携带突变的基因，因此，对FAP家系成员进行突变基因筛查具有重要意义。

3.2 云南地区FAP家系APC基因突变分析

在检测出有APC基因突变的J家系中，APC基因由第15外显子上1196密码子从编码丝氨酸变为终止密码子(S1196X)，由于是终止密码子提前出现，使APC蛋白呈截短改变，这种截短的APC蛋白丢失了其氨基端相当一部分的氨基酸序列，从而丧失其抑制肿瘤发生的生物学功能而引发肿瘤。随后对其家系另外8名成员行该突变位点的检测，其中7名成员有此突变，除一名12岁的基因突变携带者，由于未到发病年龄没发现息肉外，其他突变成员均经肠镜检查出息肉。因此，APC基因S1196X突变是引起这一FAP家系发病的原因，并且，通过对这一家系成员进行基因筛查，发现了早期的FAP患者Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅲ2、Ⅲ3及无临床表现的致病基因携带者Ⅲ4，早期给予医学干预。

此次对云南省10个FAP家系的APC基因进行分析，仅检出1个汉族家系有APC基因致病突变，突变检出率远低于国内、外报道[9～14]的23.3%～78.6%和48%～87.7%。这次研究中，我们没能确定其余9个家系的致病原因，其APC基因突变低检出率可能的原因考虑有以下3个方面:第一，FAP患者APC基因突变率可能会存在着民族间、地域间的差异。由于不同民族不同地区的人群，其遗传物质本身存在差异或长期地理隔离造成的生存环境的差异而导致遗传物质的差异，国内外现有报道已提示FAP患者APC基因的检出率在不同人种、不同地区存在差异。云南是个多民族的边疆省份，包括汉族和彝、白、回、苗、傣、傈僳、哈尼等25个少数民族以多民族大杂居、小聚居分布为特点，具有不同民族遗传结构的多样性和民族背景的单一性，APC基因突变的低检出率有可能存在云南省地区差异的因素。第二，APC基因突变阴性的FAP患者是否存在其他致病基因和修饰基因的突变。有学者报道[15]，在未检出APC基因突变的FAP患者中，碱基剪切修复基因MYH (MutY human homologue，MYH)基因突变有25%的检出率。Renkonen等[16]在未检测到APC基因变异的FAP患者中，也指出有MYH或AXIN2基因的变异。FAP患者除与APC基因突变有关外，可能还存在其他发病机制。第三，APC基因突变可能存在于这些家系中，但目前检测方法的限制，无法检测出突变部位及类型。最近，有学者报道衰减型FAP(attenuated FAP,AFAP)患者内含子突变，导致转录时剪切位点发生变化。Neklason等[17]报道1例AFAP患者4号内含子突变导致APC基因4号外显子表达缺失。我们这次研究应用DNA直接测序方法，对FAP患者APC基因的全编码区(15个外显子)进行检测，内含子未在检测范围内。另外，DNA直接测序对基因大片段缺失或整个外显子的缺失目前无法检出。虽然APC基因的大片段缺失在FAP患者中不超过2%[14,18]，内含子突变致病的报道也很罕见，但这些也可能是造成我们研究中APC基因突变低检出率的原因。

因此，对于FAP患者的基因筛查除主要的致病基因APC基因外，其他一些候选基因和修饰基因还需进一步深入研究，FAP基因筛查策略仍需进一步完善[19]。

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