甲基莲心碱对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性逆转机制的初步研究

石书红 张 辉

多药耐药(MDR)是化疗失败的主要原因，寻找有效的逆转剂一直是医学界研究的热点。甲基莲心碱(neferine,Nef)是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提出的1种双苄基异喹啉生物碱，是1种心血管方面副作用较小的新的钙通道阻滞剂[1]。我们已研究发现Nef具有增强化疗药物抑制肿瘤细胞增殖作用[2]，在体外有化疗增敏作用,本身无细胞毒作用[2]，本实验进一步研究Nef对耐长春新碱人胃癌细胞多药耐药性逆转作用及其机制，为开发具有临床意义的MDR逆转剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

甲基莲心碱(neferine,Nef)由同济医学院药理学教研室提供；长春新碱(vincristine,VCR)为广州明兴制药厂生产；维拉帕米(verapamil,VRP)为上海禾丰制药有限公司产品；MTT(噻唑蓝)为Sigma公司产品；鼠抗人Bcl-2单抗为北京中山生物工程公司产品；SP免疫组化试剂盒为福州迈新生物公司产品；小牛血清购自杭州四季清；RPMI 1640培养基为Gibco BRL公司产品。

1.2 细胞培养

SGC7901/VCR和SGC7901细胞由第四军医大学西京医院全军消化病研究所惠赠。用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。其中SGC7901/VCR 细胞加0.8～1 μg/ml VCR维持耐药，撤药后2周进行实验。选对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测VCR或Nef对肿瘤细胞增殖的影响

参照文献[2]方法，以0.5×105/ml cell接种于96孔培养板，每孔100 μl,37℃、5% CO2条件下培养过夜后，加入不同浓度的Nef和(或)VCR，调零组和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔。培养72 h后，每孔加5 mg/ml MTT 20 μl(调零组除外)，再培养4 h，倾去培养液，加DMSO 100 μl/孔，待甲臢完全溶解后，应用酶联免疫仪在波长570 nm处调零后读取吸光度值(A)。取4孔A值的均数，按以下公式计算IR,细胞生长抑制率(%)(IR)= (1-试验孔A均值/对照孔A均值)×100%。以上实验重复3次。采用孙氏法求出半数抑制浓度(IC50)，并按下列公式计算耐药及逆转倍数。

耐药倍数=耐药株IC50/ 敏感株IC50

逆转(增敏)倍数=IC50(VCR)/ IC50(VCR+Nef)

1.4 流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达

将含10 μmol/L Nef的培养液与细胞共同培养24 h，收集细胞制成1×106/ml的悬液，PBS洗2次，加入一抗(1∶100)20 μl，4℃避光反应45 min，用含2%小牛血清的PBS洗2次后，加入FITC标记的二抗(1∶200)20 μl，混匀，4℃避光反应30 min，PBS洗3次,流式细胞术检测细胞荧光强度,每次测定5 000个细胞。

1.5 免疫组化法检测细胞Bcl-2蛋白表达

将Nef加入6孔培养板中与细胞爬片培养24 h后，去掉培养液，用95%乙醇固定30 min。按SP试剂盒说明书进行操作。结果判定：细胞膜和(或)胞质被染成棕黄色为阳性细胞。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 Nef 的细胞毒性效应

由表1可见，不同浓度的Nef(2.5～10 μmol/L )对SGC7901及SGC7901/VCR细胞无显著毒性作用。

表1 Nef 对人胃癌细胞生长的影响(IR,%；n=3)

2.2 Nef 逆转SGC7901和SGC7901/VCR对VCR耐药性的作用

由表2可见，细胞株SGC7901/VCR对VCR的IC50为2.32 μg/ml，而对应的敏感细胞株SGC7901对VCR的IC50为0.059 μg/ml，可见细胞株对VCR的耐药倍数为39倍。不同浓度Nef均能逆转SGC7901/VCR对VCR的耐药性，且呈剂量依赖性；相同浓度下，Nef逆转活性较VRP高(P<0.01)，且对敏感细胞株SGC7901有增敏作用。

表2 Nef 逆转SGC7901及SGC7901/VCR对VCR的耐药作用；n=3)

与对照组(单用VCR)比较，*为P<0.05,**为P<0.01；与VRP组比较，##为P<0.01

2.3 Nef对Bcl-2表达的影响

流式细胞术检测结果显示，SGC7901/VCR与SGC7901相比波峰右移，细胞平均荧光强度增强，说明SGC7901/VCR细胞中Bcl-2表达水平增高。经10 μmol/L Nef处理24 h后，波峰左移，细胞平均荧光强度减弱，同时对其阳性表达率进行检测，发现SGC7901细胞中 Bcl-2蛋白表达率为2.95%，而SGC7901/VCR细胞中其表达率为31.94%，两组比较，P<0.01；SGC7901/VCR细胞中Bcl-2呈高表达，经10 μmol/L Nef处理24 h后，其阳性表达率下降至3.19%，与SGC7901/VCR对照组相比较，P<0.01，有显著性差异；结果表明Nef能下调SGC7901/VCR细胞中Bcl-2蛋白表达水平。

2.4 免疫细胞化学SP法检测结果

Bcl-2阳性颗粒位于胞质和(或)胞膜，MDR细胞SGC7901/VCR中 Bcl-2呈强阳性表达，而在SGC7901细胞中呈阴性表达，经10 μmol/L Nef处理24 h后，SGC7901/VCR细胞中Bcl-2表达呈阴性；表明Nef能下调SGC7901/VCR细胞中Bcl-2表达水平。

3 讨论

甲基莲心碱是1种新的钙通道阻滞剂，已有研究表明[1]具有与维拉帕米相似的心血管方面的作用。而维拉帕米是1种公认的体外具有强逆转MDR活性的逆转剂[3～5]，常做为研究MDR逆转剂的阳性对照物。已有实验证明[3～5]维拉帕米必须在2 μmol/L以上，才具有逆转MDR作用，但其在体内血浆浓度达1～2 μmol/L时，就产生明显心脏毒性：如心率减慢、低血压、房室传导阻滞、左心衰，进而限制其在临床应用。

本研究结果显示，2.5、5、10μmol/L Nef能使VCR对SGC7901/VCR细胞的IC50从2.32 μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053 μg/ml，逆转倍数分别为6.8、18.1、43.8。在浓度为10 μmol/L时，Nef逆转活性较VRP为高。说明Nef能逆转人胃癌细胞SGC7901/VCR的多药耐药性,逆转活性较维拉帕米强。另外对敏感株SGC7901细胞有化疗增敏作用。

细胞凋亡是1种区别于细胞坏死的、主动的、程序化的细胞死亡形式，细胞增殖与细胞凋亡的平衡被破坏时，肿瘤就发生，故在肿瘤的发生发展中占有重要地位[6]。研究已表明细胞凋亡与肿瘤细胞的耐药性密切相关[7]。 Bcl-2 是重要的凋亡抑制基因，其过度表达可抑制多种因素如：射线、抗癌药及去除IL-3等诱导的细胞凋亡，是肿瘤产生多药耐药性的机制之一。它与传统的肿瘤耐药机制不同，不能阻止药物进入细胞内，不抑制药物引起的DNA损伤，也不改变细胞对DNA的修补速率和细胞周期动力学，而是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径，延长细胞存活期导致耐药产生。在这一延长的存活期内肿瘤细胞可发生生化或遗传学改变，从而按经典方式产生耐药或者只受药物损伤的肿瘤细胞存活到药物作用消失后，自我修复，恢复功能[8～11]。研究发现[12，13]bcl-2能增强细胞对化疗药物耐受性，与对照组相比，bcl-2并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但对维持细胞存活起重要作用。在化疗药物去除后，bcl-2蛋白能重新启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。这说明bcl-2在肿瘤MDR发生中起重要作用。

本实验结果显示，SGC7901/VCR细胞高表达bcl-2，而SGC7901细胞不表达Bcl-2，表明SGC7901/VCR细胞的MDR与 bcl-2过度表达有关。经10 μmol/L Nef处理24 h后，bcl-2表达水平显著下降，表明Nef可能通过下调bcl-2表达水平而逆转MDR，因此，我们认为在心血管方面副作用较小的甲基莲心碱对于逆转胃癌细胞的多药耐药性具有重要意义。

[1] 叶少剑，胡文淑.甲基莲心碱的心血管作用与血管内皮及钙的关系〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，1994,8(1):43.

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