Reg Ⅳ蛋白在结肠癌组织中表达及与其发生发展的关系

郑声琴 何 杰 郑 勤 张全安

结肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，发生具有多阶段、多因素的特征，在此过程中涉及癌基因的突变和活化、抑癌基因的丢失或表达失调以及凋亡调节机制紊乱等遗传学改变[1，2]。再生基因 Ⅳ (regenerating gene Ⅳ,Reg Ⅳ) 是新发现的1个癌基因，其有可能参与肿瘤尤其是消化道肿瘤的发生和发展。基因表达的序列分析 (serial analysis of gene expressi on,SAGE) 结果得到： Reg Ⅳ在结肠正常黏膜、结肠腺癌、 胰腺癌、 胃癌和前列腺癌中均表达，尤其在结直肠腺瘤癌变区其转录水平上调特别明显，但是在结肠正常黏膜 Reg Ⅳ 基因呈低表达[3]。通过 SAGE表达谱分析认为，Reg Ⅳ基因可能是消化系统癌微转移的特异性标记物[4]，其表达上调可能与预后不良有关。我们采用免疫组织化学法,检测Reg Ⅳ蛋白在结肠癌中的表达情况，旨在探讨Reg Ⅳ在结肠癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取我院病理科 2008年～2010 年收集的102例结肠癌石蜡标本 (均取自肿瘤原发灶，均经病理检查确诊)。其中男性 70例，女性32例，年龄 31～75 (51± 30) 岁，术前均未行放疗和化疗。50例正常结肠黏膜组织术中取出经4%多聚甲醛固定后制成石蜡标本。免疫 Reg Ⅳ蛋白多克隆抗体为Santa cruz产品，稀释度为 1∶200； SABC免疫组织化学试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京天根有限公司。

1.2 方法

结肠癌标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片 (厚度 4 pm)，其中一片用于常规HE 染色，其余用于免疫组织化学。石蜡切片经脱蜡水化后入PBS (pH7.4)，经甲醇- H2O2，室温孵育20 min，除去内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗3遍；微波修复抗原，滴加抗原修复液室温 10 min，甩去血清后滴加1 ∶200 Reg Ⅳ多抗，4℃ 过夜，0.5 mol/L PBS洗2 min 3 次；滴加生物素化羊抗兔IgG， 37℃、20 min，O- SM PBS 洗 5 min 4 次；经DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。正常结肠组织对照用PBS代替一抗。

1.3 观察指标

采用Olympus光学显微镜观察，胞质或胞膜呈棕色、棕褐色者为阳性细胞。显微镜下观察 Reg Ⅳ表达强度， 标准为：0～5个肿瘤细胞染色记为0分；6 ～20个肿瘤细胞染色为1分；21～50个肿瘤细胞染色为2分；50个以上肿瘤细胞染色为3分。0分为阴性， 1～3 分为阳性。

1.4 统计学处理

应用 SPSS 11.0 统计学软件，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 Reg Ⅳ在结肠癌组织中的表达

免疫组织化学结果显示，50例正常结肠黏膜上皮中无Reg Ⅳ 表达，而102例结肠癌组织中35例 (34.31%) 呈阳性表达，两组比较差异有显著性 (P<0.05)。

2.2 Reg Ⅳ表达与结肠癌病理分级和临床分期的关系

G1级结肠癌组织与G3级比较，Reg Ⅳ阳性表达率明显增高，差异有显著性，P<0.05。T0～T4期结肠癌组织中Reg Ⅳ阳性率分别为0、33.33%、44.44%、52.38%和71.42%，差异均有显著性(P<0.05)；与T0期比较，T4期染色体分值明显增加，P<0.05，见表1。对Reg Ⅳ表达阳性率与结肠癌临床分期做回归分析，见图1，回归方程为 γ=5.955+15.83X，为直线回归，相关系数 γ=0.973，表明 Reg Ⅳ表达强度与结肠癌临床分期呈线性关系。

3 讨论

Reg家族是一群主要在肝、胰和胃肠道中发挥作用的小分子、多功能的分泌性蛋白,与组织损伤、炎症、糖尿病和肿瘤的发生密切相关。2001年Hartupee等[5]从炎症性肠病库中筛选出再生基因4 (regenerating islet-derived family,member 4,RegⅣ)，其定位于1p12-13.1，RegⅣ蛋白由158个氨基酸组成。 RegⅣ选择性表达于正常胰腺和胃肠道上皮,炎症或肿瘤组织中其表达明显增强， 提示RegⅣ与消化系统肿瘤的发生、发展可能关系密切。

表1 Reg Ⅳ表达与结肠癌组织临床病理特征的关系(例)

注： ①为与 G1相比，P<0.05；②为与T0相比，P<0.05；③为与T1相比，P<0.05

图1 Reg Ⅳ表达与结肠癌临床分期的相关性

Oue 等[6]发现虽然RegⅣ在结直肠癌 (colorectal cancer，CRC) 的表达比正常结肠组织高。36.1% (13/36) 结肠直肠腺癌是RegⅣ阳性，并与肿瘤分期有关。93.3% (14/15) 结肠直肠类癌瘤检测到RegⅣ表达。有学者[7]应用RT-QPCR和膜芯片技术，研究CRC患者外周血中RegⅣ等6种mRNA标志物的表达，发现RegⅣ mRNA过表达率为80.0% (64/80)，RegⅣ mRNA过表达与CRC TNM分期及淋巴结转移密切相关。CRC伴肝转移者RegⅣ表达阳性率明显高于无转移病例。 RegⅣ阳性表达CRC比阴性表达存活率低 。ELISA法检测CRC患者术前血清RegⅣ水平显示Ⅳ期CRC伴肝转移患者较0～Ⅲ期患者明显升高，说明RegⅣ是预后不良的预测因子,血清RegⅣ浓度可能预测CRC并发肝转移。Violette 等[8]应用差异展示PCR法，分析发现RegⅣ在CRC耐药细胞中高表达,在敏感细胞系则是低表达,提示RegⅣ在CRC中的潜在作用,而且可能是影响肿瘤患者存活率的预后指标并与肿瘤的耐药性有关。

Oue 等[7]发现29.4%的胃癌RegⅣ呈阳性表达,并与小肠黏蛋白表型和神经内分泌分化有关。定量RT-PCR分析显示RegⅣ在30.4%的胃癌组织中呈高水平表达，而在正常胃、十二指肠、回肠、结肠、胰腺都呈低水平表达。Sentani 等[9]对多种组织印戒细胞癌 (signet-ring cell carcinoma,SRCC) 进行免疫组织化学分析，发现RegⅣ染色有助于胃肠道SRCC的诊断。Takehara 等[10]报道RegⅣ在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)细胞中过表达。 RegⅣ蛋白呈时间剂量依赖性促进PDAC细胞的生长，通过RNA干扰技术可阻断RegⅣ的促生长效应,同时外源性RegⅣ蛋白促进PK-45P细胞的Akt的磷酸化， 提示RegⅣ的促生长效应可能通过PKB/Akt信号通路来介导， 以抗体中和RegⅣ效应可能是一潜在的治疗PDAC的工具。早期PDAC患者血清中呈现RegⅣ水平的显著提高， 血清RegⅣ可能是检测早期PDAC的肿瘤标志物。然而， RegⅣ在CRC、 GC、炎症性肠病、阑尾黏液囊腺瘤和腹膜假性黏液瘤 (pseudomyxoma peritonei,PMP)、前列腺癌和唾液腺囊性腺样癌中高表达,所以血清中RegⅣ水平的升高在诊断中的灵敏度和特异度还要大量基础研究的证实。本实验结果显示：Reg Ⅳ在结肠癌中的表达明显高于正常结肠组织 ；在结肠癌细胞中 G1、G2和G3级表达分别为 0 、22.22%和68.66%，与G1相比，G3级染色分值明显增加，两者间比较，差异有显著性。结果表明，Reg Ⅳ与结肠癌分化密切相关，分化程度越低，其表达越高，提示Reg Ⅳ有可能是结肠癌病理分级诊断的辅助指标，通过研究两者相关性我们发现两者呈线性关系，这也表明Reg Ⅳ表达水平随结肠癌侵袭力增强而增高。Reg Ⅳ有望作为1种有价值的生物标志物来评估结肠癌的恶性程度，对治疗方案的选择和术后随访提供指导，提示Reg Ⅳ与结肠癌的发生及演变过程密切相关，对结肠癌行Reg Ⅳ蛋白的检测有可能作为临床判断结肠癌生物学行为浸润深度的一项重要指标，但其作用机制还有待进一步探讨。谷化平等[11]研究认为VEGF、EGFR和PTEN与结肠癌的浸润和转移有关，可作为判断结肠癌预后的指标，而VEGF和EGFR是目前临床应用较广的检测指标，Reg Ⅳ的作用是否与VEGF、EGFR相关，可能是我们下一步研究的内容之一。

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