葡萄膜炎患者外周血T细胞TCR BV亚家族克隆性的初步研究

魏克娜，黄红艳，张璐，邹红云，余伍忠，焦敏

（1石河子大学医学院免疫学教研室，石河子832002；2兰州军区乌鲁木齐总医院眼科，乌鲁木齐830000；3兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所，乌鲁木齐830000）

葡萄膜炎患者外周血T细胞TCR BV亚家族克隆性的初步研究

魏克娜1，黄红艳2，张璐1，邹红云3，余伍忠3，焦敏3

（1石河子大学医学院免疫学教研室，石河子832002；2兰州军区乌鲁木齐总医院眼科，乌鲁木齐830000；3兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所，乌鲁木齐830000）

为探讨葡萄膜炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）TCR BV CDR3谱系特点及多态性，为其免疫发病机制研究提供实验基础。采用RT－PCR扩增TCR BV 26个亚家族CDR3的方法，经免疫扫描谱型技术分析对葡萄膜炎患者PBMC中TCR BV CDR3的谱系漂移情况进行研究。结果显示：（1）5例正常健康人PBMC TCR BV CDR3谱型绝大多数呈正态（或高斯）分布，4例葡萄膜炎患者TCR BV CDR3扫描谱型均出现非正态分布的异常峰型，包括寡峰／寡峰趋势，偏峰和不规则异常峰型；（2）在26个TCR BV亚家族中，不同亚家族异常峰型出现的频率不同，非正态异常峰型出现频率较高的亚家族有BV2和BV17（均为3／4），而BV5.2、BV6、BV15和BV18亚家族均未出现异常峰型；（3）TCR BV2和BV17两个亚家族在HLA－B27阴性的3个患者均出现非正态异常峰型，而在HLA－B27阳性（合并强直性脊柱炎）的患者并未出现异常。葡萄膜炎患者PBMC TCR BV部分亚家族的异常表达可能与该病的免疫发病机理有关，为葡萄膜炎发病机制的进一步研究提供依据。

葡萄膜炎；T细胞受体；BV亚家族；互补决定区3；免疫扫描谱型分析；克隆性

葡萄膜炎是较常见的一种眼部疾病，近年来，葡萄膜炎所致盲目在全部盲目病例中所占比例达4%～10%，且有持续上升的趋势［1－2］，因此，葡萄膜炎的研究在致盲眼病领域中日益受到学者们的重视。其病因复杂，除了外伤、感染等因素可引起以外，多数观点认为，自身免疫紊乱所致的葡萄膜炎为最常见和最重要的类型。因此，大量研究均从免疫学角度来探讨其发病机制。自1973年Brewerton等［3］首次报道人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）B27与急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AUU）有密切相关性以来，免疫遗传研究已发现20多种眼病与 HLA－B27抗原相关［4］。

对葡萄膜炎脉络膜病理学检查发现炎症区眼内炎症以淋巴细胞和浆细胞反应为主，淋巴细胞弥漫浸润整个脉络膜，视网膜有不同程度的破坏［5］，表明体液免疫和细胞免疫均参与葡萄膜炎的发生过程。

近年来，葡萄膜炎被认为是针对特定眼部蛋白的抗原特异性T淋巴细胞介导的自身免疫性反应［6－7］。因而，T淋巴细胞在葡萄膜炎致病中的作用机制引起广泛关注。目前，对葡萄膜炎相关免疫活性T细胞的研究报道非常少。

TCR是T细胞表面特异性识别抗原的分子，在TCR胚系基因的形成过程中，TCRβ链按等位排斥的方式先于TCRα链的重排，能较好反映T细胞TCR的特征。TCR重排过程中，互补决定区3（CDR3）形成高度可变区（NNDNJ区），是TCR直接与抗原决定簇结合的区域。不同重排其CDR3长度不同，通过检测不同亚家族CDR3长度，可以了解TCR不同亚家族的克隆性特点。本研究拟采用基因扫描技术来分析探讨葡萄膜炎患者TCR BV CDR3谱系特点及多态性，旨在为探索T细胞在葡萄膜炎免疫发病机制中的作用机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择

4例葡萄膜炎均来自兰州军区乌鲁木齐总医院门诊和住院患者，患者编号为U1～U4，其中U1～U3均为HLA－B27阴性，U4为HLA－B27阳性合并强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS），其中女性1例（为U1），男性3例（为U2～U4），年龄为24～45岁。所有葡萄膜炎患者的诊断参照文献［8］中的诊断标准，强直性脊柱炎诊断符合文献［9］中的诊断标准，并排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病。5例正常健康人为对照。所有入选者采集乙二胺四乙酸二钾（EDTA）抗凝静脉血5mL。

1.2 RNA提取及cDNA合成

按RNA提取试剂盒（Omega Bio－Tek，美国）提取4例葡萄膜炎患者和2例正常健康人PBMC（2.0×106细胞）中的总RNA，RNA进行浓度测定［10］，按照cDNA Kit条件合成cDNA。

1.3 TCR BV基因和TCR BC基因引物设计和合成

参照文献［11－12］，合成 TCR BV 亚家族上游引物26条；TCR BC共用下游引物1条（内侧端带FAM荧光标记），TCR BC对照引物1条，引物由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 PCR扩增TCR BV基因26个亚家族

PCR反应体积为50μL，含cDNA模板2μL，10 mmol／L dNTP 1μL，10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL，TCR BV上游引物2μL（所有的TCR BV上、下游引物的应用浓度均为10μmol／L），下游共用TCR BVFAM引物2μL，Taq DNA多聚酶1.25U。反应条件为：94℃变性3min；94℃1min，55℃1min，72℃1 min，35个循环；72℃10min延伸。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶（溴乙锭染色）中进行电泳，剩余PCR产物于－20℃保存备用。

1.5 基因扫描（GeneScan）分析T细胞克隆

取TCR BV各家族带FAM荧光标记的PCR产物2μL，加入2μL去离子甲酰胺（Hi－Di Formamide，ABI），0.5μL 标准品（ABI，Genescan 500－Tamra，其中含有不同大小的荧光素Tamra标记的DNA片段）及0.5μL上样缓冲液（25mmol／L EDTA，50mg／mL blue dextran），94℃变性4min后，每管取2μL于6%变性聚丙酰胺凝胶中电泳2h，并用373ADNA序列分析仪（ABI，Perkin Elmer公司）分析结果，通过分析软件GeneScan672、激光扫描及计算机收集电泳过程中不同时间所出现的不同颜色和强度的荧光素而显示出不同位置、高度、颜色和形态的峰。

2 结果与分析

2.1 PBMC TCR BV 26个亚家族RT－PCR结果

正常健康人和葡萄膜炎患者的PBMC TCR BV26个亚家族及TCR BC对照均有表达，在2%琼脂糖凝胶电泳图上预测相应大小处显示1条特异性的条带（图1）。

2.2 TCR BV基因扫描分析结果

5例正常健康人PBMC TCR 26个BV亚家族多包含8～10个相差3bp片段大小的产物，因此谱型均呈现8～10个中间高，两端低的钟型峰图，即呈正态分布或高斯分布（图2）。

图1 正常人TCR BV 26个亚家族和TCR BC对照产物2%琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 2%agarose gel electrophoresis of the PCR products of TCR BV families in a normal control

图2 正常人PBMC TCR BV 26个亚家族CDR3谱型基因扫描分析图Fig.2Spectratyping of CDR3sizes for all 26TCR BV gene families in PBMC in a normal control

所有患者外周血TCR BV CDR3亚家族扫描谱型中均出现非正态分布的异常峰型，包括寡峰、偏峰及不规则异常峰型，表明患者T细胞有寡克隆／寡克隆增生趋势及其他异常多克隆增生；但未发现单克隆增生的亚家族。不同患者的TCR BV 26个亚家族异常峰型出现率为31%（8／26）～50%（13／26），其中U4患者异常峰型率最高（表1）；不同患者26个TCR BV亚家族中均出现3～9个寡克隆／寡克隆趋势增生的亚家族，其中U4（葡萄膜炎合并AS）患者寡克隆／寡克隆趋势的峰型出现频率最高（9／26）（表1）。

在26个TCR BV亚家族中，不同亚家族非正态异常峰型出现的频率不同，非正态异常峰型出现频率较高的亚家族有BV2和BV17（均为3／4），而BV5.2、BV6、BV15和BV18亚家族均未出现异常峰型；寡峰／寡峰趋势出现频率较高的亚家族为BV9、BV22、BV24（均为2／4）；偏峰出现频率较高的亚家族为BV21（2／4）；不规则异常峰型出现频率较高的亚家族为BV17（3／4）。结果还发现，TCR BV2和BV17在HLA－B27阴性的3个患者（U1～U3）中均出现异常峰型，而在HLA－B27阳性的患者（U4）并未出现这2个亚家族的异常（图3）。

表1 4例葡萄膜炎患者TCR BV亚家族的异常峰型率Tab.1 4cases of uveitis patients TCR BV subfamily of the abnormal peak rate

图3 葡萄膜炎患者TCR BV出现单、寡克隆增生、偏峰及不规则异常峰的家族Fig.3Monoclonal expansion，oligoclonal expansion，skewing family and abnormal family of TCR BV in the uveitis patients

3 讨论

葡萄膜炎大多由自身免疫反应所引起，视网膜中有多种抗原，每种抗原又有多个致葡萄膜炎活性多肽［13］。Yamamato等［14］用S抗原刺激葡萄膜炎患者体外培养的T淋巴细胞，发现患者的T细胞发生免疫反应，而无葡萄膜炎患者与正常对照组相比，无统计学差异，因此，推测S抗原可能是一种自身隐蔽抗原，当患者眼组织受损或者其他原因引起S抗原暴露后才诱发免疫反应，从而造成葡萄膜炎性损伤。

对TCR BV 26个亚家族基因的克隆性特点进行分析可以了解T细胞的性质以及机体的免疫状况。正常情况下，机体未受任何抗原刺激时，TCR BV重排是随机的，T细胞表现为正态多克隆性；但在疾病情况下［15－18］，特殊的抗原刺激可引起某个或几个亚家族的TCR BV针对性重排，出现异常克隆性增生，优势表达的T细胞克隆可以抑制其它克隆的T细胞，造成机体免疫功能低下。

本研究采用免疫扫描谱型分析技术对5例正常健康人TCR BV亚家族的CDR3谱系分析发现26个亚家族RT－PCR产物大小不完全一致，提示T细胞在胚系发育重排时的多样性。对4例葡萄膜炎患者TCR BV亚家族的CDR3谱系和克隆性表达分析发现，所有葡萄膜炎患者外周血T淋巴细胞均出现多个TCR BV亚家族谱型的异常改变，表明葡萄膜炎患者T细胞存在异常。葡萄膜炎患者部分亚家族出现寡克隆／寡克隆趋势增生的表达情况，造成这种1个患者出现多个寡克隆增生的TCR BV亚家族以及不同患者不同家族呈现优势增生，这有可能是多种抗原所引起的一种特异性免疫应答，说明在相关抗原的刺激下，TCR BV亚家族出现谱系多态性和异常克隆增生。目前对这一过程以及克隆性增生的T细胞在体内的功能意义还不十分清楚，仍需进一步研究。每个患者出现多个寡克隆性T细胞增生表明葡萄膜炎抗原的多态性，不同患者出现的寡克隆T细胞的亚家族也不同，这可能与不同患者的反应性不同有关。

本研究的结果还显示，葡萄膜炎合并AS的U4患者出现寡克隆增生亚家族异常程度的频率最高，提示葡萄膜炎合并AS的TCR BV亚家族异常程度有可能高于单纯的葡萄膜炎，但由于本研究病例数较少，还有待于进一步研究确证。

本研究对葡萄膜炎TCR BV CDR3谱型扫描分析结果仅发现了部分寡克隆／寡克隆趋势增生的亚家族，未发现单克隆增生亚家族，进一步增加样本含量有可能发现更多的寡克隆甚至单克隆增生亚家族，有助于进一步认识葡萄膜炎患者TCR BV CDR3谱系多态性特点；进一步对寡克隆增生亚家族CDR3进行序列分析则有可能发现与葡萄膜炎相关的CDR3共同氨基酸序列，从而有可能为阐明葡萄膜炎特异性T细胞抗原在免疫发病机制中的确切作用，发现葡萄膜炎相关特异性抗原及免疫学发病机制的探讨提供有价值的线索，并为靶向免疫治疗开辟新途径。

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Study on the T cells of TCR BV CDR3 Lineage Polymorphism in Peripheral Blood of Uveitis Patients

WEI Kena1，HUANG Hongyan2，ZHANG Lu1，ZOU Hongyun3，YU Wuzhong3，JIAO Min3
（1Department of Immunology，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832002，China；2Urumqi General Hospital of Lanzhou Command of PLA，Ophthalmology Dept，Urumqi 830000，China；3Urumqi General Hospital of Lanzhou Command of PLA，Institute of Clinical Medical Research，Urumqi 830000，China）

To study T cells lineage polymorphism of TCR BV CDR3in peripheral blood of uveitis patients so as to provide experimental basis to immune pathogenesis research in uveitis.T cells TCR BV 26subfamily CDR3of uveitis patients PBMC were amplified by RT－PCR method，then TCR BV CDR3lineages polymorphism were analyzed by immunization scanning spectrum.Results：1）Most spectral type of PBMC TCR BV CDR3in five normal controls showed Gauss distribution，TCR BV CDR3scanning spectrum of 4cases uveitis patients all showed abnormal distribution peak，including oligoclonal／oligoclonal trend，skewing peak and irregular abnormal peak；2）Frequencies of abnormal peak type occurrence varied in the 26TCR BV subfamilies：high frequency abnormal peak type subfamilies were BV2and BV17（both 3／4），while BV5.2，BV6，BV15and BV18subfamilies had no abnormal peak type；3）TCR BV2and BV17two subfamily in three patients with HLA－B27negative showed abnormal peak type，while HLA－B27positive（complicating ankylosing spondylitis）patients did not appear abnormal.Uveitis in patients with PBMC TCR BV subfamily expression might be related to immune pathogenesis.This study provides a foundation for further research into the mechanism of uveitis.

uveitis；T cell receptors；BV subfamilies；complementarity determining region3；immunoscope spectratyping；clonality

R392.9；R773.9

A

1007－7383（2012）01－0051－05

2011－12－16

国家自然科学基金（81172840），兰州军区医药卫生科研基金资助项目（CWS10JA21）

魏克娜（1982－），女，硕士生，专业方向为分子免疫；e－mail：weiyi0922＠163.com。

邹红云（1970－），女，副主任医师，从事自身免疫病发病机制的研究；e－mail：yijiamin2000＠163.com。