小拟南芥高盐胁迫诱导cDNA文库的构建与测序分析

院海英，徐芳，吕新华，崔百明，黄先忠

（石河子大学生命科学学院／石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子832003）

小拟南芥高盐胁迫诱导cDNA文库的构建与测序分析

院海英，徐芳，吕新华，崔百明，黄先忠

（石河子大学生命科学学院／石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子832003）

以新疆小拟南芥为材料，分离了小拟南芥经500mmol／L NaCl胁迫处理的幼苗总RNA，采用改良的SMART cDNA合成方法合成第一链cDNA，采用LD PCR的方法合成第二链cDNA，经BP反应重组到入门载体pDONR207上，构建了小拟南芥高盐胁迫的入门cDNA文库。文库插入片段平均大小为1.1kb，阳性克隆率为94%。文库经随机挑选克隆测序，生物信息学分析初步获得了10个有功能的基因，其中包含各种酶如水解酶、氧化还原酶等；功能蛋白如离子运输通道蛋白、胁迫诱导蛋白，细胞色素蛋白及激素受体蛋白基因等。可以利用入门文库构建各种目的cDNA文库，本研究为将来从小拟南芥中筛选耐盐基因奠定了基础。

新疆小拟南芥；耐盐；入门文库；表达文库；BP重组

早春短命植物，在新疆分布丰富。由于其生活史短，具有一定的抗寒、抗旱、耐盐碱能力，而备受关注。小拟南芥（Olimarabidopsis pumila）为无苞芥属（Olimarabidopsis），其亲源关系与模式植物拟南芥十分接近［1－2］，且比拟南芥具有更好的耐盐性能［3－5］，从小拟南芥中挖掘耐盐相关基因，并进行相关功能研究，不仅能丰富植物响应高盐胁迫的分子机理，也可利用耐盐基因培育耐盐作物品种。

对于基因组序列未知的物种，构建全长cDNA文库，是进一步开展分子生物学研究的基础。经典cDNA文库的创建不能满足大规模、高通量筛选新基因的要求［6］。当前，很多新的合成全长cDNA文库的构建方法得到了发展，已成为功能基因组学研究的重要手段之一［7］。

Gateway技术利用噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将cDNA穿梭到入门载体上，形成入门文库，然后根据研究目的不同选择不同的表达载体，通过LR反应使cDNA定向重组到任何Gateway化的表达载体上，形成各种表达文库，整个过程无需酶切、连接，而且克隆效率高［8］。利用Gateway系统构建高盐胁迫cDNA文库，从中筛选耐盐相关基因，已在一些植物研究中运用。

本研究参照Ni等［9］的方法，采用一种改良的SMART cDNA第一链合成的方法，在cDNA的5′及3′分别连上位点特定的接头attB1和attB2，采用attB1和attB2序列特定的引物通过LD PCR的方法合成第二链cDNA，并通过BP重组反应建立了新疆小拟南芥经500mmol／L NaCl胁迫的幼苗cDNA入门文库，并进行文库分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

哥伦比亚生态型拟南芥（Col－0）和新疆小拟南芥（Olimarabidopsis pumila）种子为本实验室保存。

1.1.2 菌株及质粒

大肠杆菌Top10、入门文库载体pDONR207由中国科学技术大学向成斌教授馈赠。

1.1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒Trizol、反转录酶superscript III RTase、BP clonase均购自Invitrogen公司。低融点琼脂糖（BIO BASIC INC）、β－agaraseⅠ（New England Biolab）、Ex Taq（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 小拟南芥的培养

拟南芥和小拟南芥种子灭菌及播种方法参照院海英等［5］的方法进行。首先将拟南芥和小拟南芥种子播种在1／2MS培养基上，生长1周后将幼苗转入含500mmol／L NaCl的1／2MS培养基培养，盐胁迫处理3d后观察幼苗生长状况。构建文库的幼苗材料处理12h，将整株材料迅速置于液氮中冷冻，－80℃冰箱保存。

1.2.2 引物的设计及合成

参照文献［9］中的方法设计引物，由北京六合华大基因科技有限股份公司合成。引物见表1。

表1 研究所用引物名称Tab.1PCR primers used in this study

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取参照Trizol试剂盒说明书提取。cDNA第一链的合成方法参照Ni等［9］的方法进行。反应体系经42℃水浴1h再加入模板转换引物attB1－（r）G3，然后再42℃水浴1h。

双链cDNA的合成采用LD PCR的方法进行。PCR反应体系如下：在100μL的反应体系中，加入2μL first strand cDNA，10×Ex Taq Buffer 10μL，2.5mmol／L dNTPs 8μL，attB1 （10μmol／L）2 μL，attB2（10μmol／L）2μL，1UEx Taq，ddH2O补齐。反应程序为：95℃，2min后，95℃5s，64℃10s，72℃6min，20个循环，72℃延伸6min。取5 μL上述PCR产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测双链cDNA质量。

1.2.4 入门cDNA文库的构建

LD PCR产物经1.0%低融点琼脂糖电泳，将大于500bp的片段切胶，低熔点胶经β－agaraseⅠ酶解，具体方法参照说明书进行。建立10μL的BP重组反应，包含约100ng纯化的双链cDNA，pDONR207质粒约100ng，2μL BP ClonaseⅡenzyme mix，1×TE Buffer（pH 8.0）补齐。25℃，过夜悬浮后，加2μL蛋白酶K，37℃10min，终止反应。重组反应产物通过电击转化感受态细胞Top 10，加入1mL SOC培养基，37℃，150r／min，轻摇1h，复苏后，加入已高压灭菌的甘油，使其终浓度达30%，即为构建好的入门cDNA文库，经液氮速冻，－80℃保存备用。

1.2.5 文库效率及测序分析

文库效率分析采用文献［6－7］中的方法。随机挑选不同的克隆，采用文献［9］中的方法提取质粒，质粒PCR引物为attL1和attL2。测序引物为attL1，测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果利用DNAstar软件分析载体及引物序列后，采用 blast（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blasp）比对分析。

2 结果与分析

2.1 小拟南芥的盐胁迫处理与RNA的提取

生长1周的拟南芥和小拟南芥幼苗经500 mmol／L NaCl胁迫培养基培养3d后，发现拟南芥基本白化死亡，而小拟南芥部分萎蔫，但依然正常生长（图1），说明小拟南芥具有一定的耐盐能力，这和前期的研究结果［5］一致。

图1 500mmol／L NaCl对拟南芥和小拟南芥的幼苗生长的影响Fig.1Comparison of shoot growth of Arabidopsis thaliana and Olimarabidopsis pumilastressed under 500mmol／L NaCl

取经胁迫处理12h的幼苗，液氮研磨，提取总RNA。提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，清楚的看到28S和18S的条带（图2），分光光度计检测，结果表明OD260／OD280＝2.0，RNA浓度为1.27 μg／μL，说明RNA质量较好。

图2 小拟南芥经500mmol／L NaCl胁迫处理的总RNA电泳图Fig.2Total RNA isolated from Olumiarabidopsis pumila stressed under 500mmol／L NaCl

2.2 改进的SMART PCR提高了cDNA合成的质量

提取的总RNA采用改进的SMART方法合成cDNA第一链［9］。第二链cDNA合成采用LD－PCR的方法。合成的双链cDNA经电泳检测从上到下显示一片“smear”，表明产生了更多高分子量的cDNA，合成的cDNA质量更好（图3）。

图3 双链cDNA电泳图Fig.3Agarose gel electrophoresis of double strand cDNA

2.3 cDNA文库的构建与分析

经检测，入门文库的滴度约为6×105cfu／mL，文库总量约为1.2×106cfu。随机挑取100个克隆，提取质粒，利用attL1和attL2引物扩增，PCR产物经电泳检测（图4），表明阳性克隆率为94%，插入片段平均大小约1.1kb。这表明采用改进的SMART cDNA合成方法增强了cDNA合成的能力，文库质量更高。

图4 琼脂糖凝胶电泳检测cDNA文库质量Fig.4Agarose gel assays for cDNA inserts

随机挑选30个克隆，利用attL1引物测序，测序产物去除载体序列，经blast比对分析，其中10条具有同源基因及功能注释（表2）。10个基因可以分成酶，包含烯醇酶、水解酶、氧化还原酶等；功能蛋白，如反向运输蛋白，铝诱导蛋白，细胞色素C家族蛋白，赤霉素受体蛋白等。

表2 cDNA文库测序分析Tab.2Sequencing analysis of cDNA library

3 结论与讨论

在构建入门cDNA文库时，需要考虑两个因素。一是cDNA质量，二是怎样从较少的起始材料中获得高质量的cDNA［7］。通过PCR扩增第一链cDNA是一种从较少材料中获得较高丰度双链cDNA的有效方法，但需考虑两点因素，首先cDNA第一链的5′和3′端要具有PCR扩增的锚定引物，其次引物序列保证要有发生重组反应的位点。本研究在合成第一链cDNA时3′末端加上attB2序列，通过模板转换在5′末端和attB1接头序列结合，随后利用带有重组位点的attB1和attB2引物，通过PCR扩增获得双链cDNA，双链cDNA也很容易进行BP重组反应。

构建的小拟南芥经500mmol／L NaCl胁迫的入门cDNA文库，经分析及随机测序表明符合cDNA文库的要求，随机测序表明一些酶类基因所占比例较高，而且发现1个类似拟南芥液泡膜反向运输蛋白基因Vacuolar Na＋／H＋antiporter的基因，植物抵御盐胁迫的有效策略之一是将细胞质中过多的Na＋区隔化在液泡，这一过程是由液泡膜Na＋／H＋逆向转运蛋白完成的［10］。另外还有一个类似拟南芥赤霉素受体的基因GID1C，已有研究［11］表明，GID1C与阻遏植物生长的DELLA蛋白相互作用，NaCl胁迫下，植物细胞DELLA蛋白高度积累，从而抑制植物生长，有利于植物抵御不良环境。

新疆小拟南芥能在新疆逆境自然环境下广泛生存，可能会有一些新的不同于其它植物的耐逆基因，也可能存在一些在逆境胁迫下特殊表达的基因，使小拟南芥能够进化出一套响应逆境而生存的机制。利用本研究构建cDNA文库，无需酶切、连接等繁琐的亚克隆策略，构建的入门文库符合cDNA文库质量要求，可以根据下一步实验的目的将入门文库穿梭到不同的目的载体上，为进一步从小拟南芥中挖掘新的耐盐相关基因奠定基础。

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Construction and Sequencing Analysis of cDNA Library Induced by High Salt Stress in Olimarabidopsis pumila

YUAN Haiying，XU Fang，LÜXinhua，CUI Baiming，HUANG Xianzhong
（College of Life Science／Key laboratory of Agrobiotechnology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Total RNA was isolated from shoot of Olimarabidopsis pumila stressed with 500mmol／L NaCl.The first－strand cDNA was synthesized with superscript III RTase through an improved SMART cDNA synthesis method，the second－strand was synthesized via LD PCR amiplification，and the double－strand cDNA was recombined into entry vector pDONR207via Gateway BP Clonase.The entry cDNA library of Olimarabidopsis pumilainduced by high salt stress was thus constructed，with an average inserts size of 1.1kb，and the positive clone rate of 94%.Randomly－selected clones were sequenced，and through bioinformatics analvsis，10functional genes were obtained，including different enzymes such as oxidoreductase，hydroylase，etc，and function proteins，such as ion transporter proteins，stress induced protein，cytochrome b5protein，and phytohormone receptor protein，etc.Various expression libraries can be constructed based on the entry library，and this study laid a foundation of mining salt－tolerance genes fromOlimarabidopsis pumila.

Olimarabidopsis pumila；salt tolerant；entry library；expression library；BP recombination

Q943.2

A

1007－7383（2012）01－0001－04

2011－11－02

国家自然科学基金项目（31060149），石河子大学高层次人才启动项目（RCZX200902）

院海英（1985－），女，硕士，专业方向为植物遗传学；e－mail：yuanhaiying315＠126.com。

黄先忠（1974－），男，副教授，博士，从事植物遗传学与基因组学研究；e－mail：xianzhongh＠shzu.edu.cn。