氦氖激光与紫外线B辐射对小麦幼苗根氮代谢相关酶的影响

李素花，孙永星，韩榕

（山西师范大学生命科学学院，临汾041000）

氦氖激光与紫外线B辐射对小麦幼苗根氮代谢相关酶的影响

李素花，孙永星，韩榕

（山西师范大学生命科学学院，临汾041000）

为研究He－Ne激光辐照对小麦幼苗根氮代谢相关酶受UV－B辐射损伤后的修复作用，分别采用5mW·mm－2He－Ne激光辐照、10.08kJ· m2·d1的UV－B辐射及二者组合对临优2018号小麦幼苗进行处理，3d后测定各处理组小麦幼苗根一氧化氮合成酶含量和硝酸还原酶活性的变化。分析结果显示：He－Ne激光辐照可使UV－B辐射后小麦幼苗根一氧化氮合成酶（NOS）含量增加4.7%，硝酸还原酶活力升高1.01倍，显著改善了增强UV－B辐射后硝酸还原酶（NR）活性降低的程度。表明一定剂量的He－Ne激光辐照可部分修复增强UV－B对小麦幼苗根氮代谢水平的辐射损伤。

UV－B辐射 He－Ne激光 小麦；一氧化氮合成酶 硝酸还原酶

大气臭氧层减薄导致到达地面的太阳紫外线B辐射增强，这对地球上的植物产生一定危害［1］。目前，国内外学者针对紫外线辐射对植物的光合作用、DNA损伤、遗传特性、次生代谢和生态系统等方面研究十分活跃［2］。近年来有关UV－B辐射增强和激光对氮代谢影响的研究已有报道。Manuela等［3］研究发现UV－B辐射后紫萍的硝酸还原酶（NR）活性受到明显地抑制作用；余弘［4］发现经UV－B辐射后紫萍叶状体NR活性先升高后降低；侯扶江等［5］研究发现UV－B辐射可抑制大豆幼苗的NR活性，但对小麦NR合成有一定的促进作用；刘清华［6］研究结果表明UV－B辐射下银杏叶片NR活性呈先升后降趋势；郝金花等［7］研究发现UV－B辐射后小麦幼苗叶片NR活性先升高后下降。Putnova等研究表明激光能促进NR活性提高。

在正常条件下，植物体内NO含量比较稳定。一氧化氮合成酶（NOS）是NO合成的主要酶，因此，正常情况下植物体内NOS含量是比较稳定的。在胁迫环境中，植物体要通过胁迫信号的传递引起植物体内发生相应的生理生化反应来提高抗逆能力，从而使植物能够抵御逆境而得以生存。李翠等［8］研究发现NOS在植物应对各种逆境胁迫中发挥功能；曲颖［9］研究发现UV－B辐射能够显著增加NO释放率，并能诱导豌豆茎细胞质中NOS活性升高。

本研究采用氦氖激光辐照方法，测定增强UVB辐射下的小麦幼苗根的NR活性和NOS含量，旨在阐明He－Ne激光对小麦氮代谢过程中关键酶在受到UV－B损伤后所起的修复作用。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为临优2018号小麦品种，其种子由山西省农业科学院小麦研究所提供。

1.2 种子萌发

选取籽粒饱满、大小均匀的小麦种子，经0.1%HgCl2消毒后，在25℃条件下培养于盛有湿滤纸的培养皿中，直至种子露白时备用。每皿30粒，每组3次重复。

1.3 种子处理

1.3.1 处理设置

本试验设置CK、B、L、BL 4个处理组（表1）。

表1 各处理组的设置Tab.1Setting of the treatment groups

1.3.2 UV－B辐照

UV－B发生装置采用 UV－B灯，采用10.08kJ／（m2·d）的 UV－B辐射剂量。相当于臭氧下降20%、UV－B增强40%的强度。每天处理8h，然后转入暗处培养。

1.3.3 氦氖激光辐照

He－Ne激光器波长为632.8nm，光斑直径5 cm。选用的辐照剂量、时间、温度分别为5mW／mm2、2min、25℃。激光辐照处理安排在每天夜间进行，以排除杂光影响，激光处理后立即转入暗处25℃下培养。

1.3.4 指标的测定

1.3.4.1 取样方法

各处理组不同处理天数对各指标的影响，从处理第3天开始每隔1d连续取样，均在每天处理1h时取样，共8个处理时间。

1.3.4.2 NOS粗酶液的提取及含量测定

参照曲颖的方法［9］，略有改进。取小麦的幼苗根，加入50mmol／L Tris－Hcl缓冲液 （含1mmol／L EDTA，10－3mmol／L亮抑肽酶，7mmol／L还原型谷胱甘肽，0.2mmol／L PMSF，pH7.5），冰浴下研磨，4℃下离心30min，10000g，取上清液于100000 g，4℃下离心30min，上清液即为NOS。

按陈煜等的方法［10］。称取0.5g小麦幼苗根，加5mL HEPES 提 取 液 （20mmol／L HEPES，5 mmol／L EDTA，5mmol／L 半胱氨酸，pH7.5），冰浴研磨成匀浆，4℃下3000r／min离心15min。

上清液即酶的粗提液用于NR活性的测定，具体测定方法参照张志良的方法［11］。

1.3.5 数据分析

采用Excel 2003进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 NOS含量的变化

氦氖激光与增强UV－B辐射在不同处理时间对小麦幼苗根NOS含量的影响结果见图1。

图1a显示：随着处理天数的延长，CK组与L组NOS含量呈现相似的降－升－降的变化趋势，并且L组始终高于对照组。其中，CK组在第7天时降至2.055mg／g，较其第3天时的NOS含量降低了42.71%，二者差异极显著；L组在第7天时降至2.33mg／g，较其第3天时的NOS含量降低了35.08%，二者差异极显著；第8天时CK组与L组NOS含量分别回升至2.102mg／g和2.371mg／g，但均与其第7天时的含量差异不显著（P＞0.05）；第10天时CK组与L组均降至最低值0.401mg／g和0.823mg／g，较其第3天时NOS的含量降低了88.83%和77.09%，二者差异均极显著。

2）B、BL组的NOS含量均大致呈现升—降—升得变化趋势，且始终高于对照组，同时BL组始终高于B组。处理的第5天，B组和BL组的NOS的含量分别达到最高值4.379mg／g和4.584mg／g；随后开始下降，在第7天时B组和BL组分别降到较低值2.467mg／g和2.636mg／g，但高于相同时间段 CK组和L组的NOS含量。在7－9d内呈现上升趋势，第9天时B组和BL组分别达到较高值2.657mg／g和3.000mg／g，但未达到第5天时的NOS含量；第10天时B组和BL组分别降到最低值0.935mg／g和1.246mg／g，但仍高于相同时间段CK组和L组的NOS含量，差异极显著（P＜0.01）。

1910年夏，俄国派以波波夫为首的考察队前往唐努乌梁海进行详细考察，在途中成员奥古斯图斯焚毁了唐努乌梁海西南边境察布齐雅勒达坝的界牌⑥ 樊明方.唐努乌梁海历史研究〔M〕.北京:中国社会科学出版社,2007.第215页。，然后俄国政府开始公然提出乌梁海是“有争议地区”，无视历史上中俄条约的规定，为以后侵占唐努乌梁海制造根据。1911年初，俄国出现大量有关唐努乌梁海的书籍和报刊，歪曲事实，鼓吹侵占唐努乌梁海。

3）整体来看，5－10d内，各处理组NOS含量大小均表现为BL＞B＞L＞CK，并且各组的NOS含量均在第5天时达到最大值，表明NOS在培养第5天时合成最旺盛。这说明，各处理组内部NOS含量随着处理天数的延长有着一定的变化，各不同处理对其自身合成的变化趋势影响不显著，但在相同时间段不同处理对NOS含量有显著的影响，其中增强UV－B辐射对小麦幼苗根NOS合成有一定的促进作用，在UV－B处理第5天时NOS含量明显升高，氦氖激光在处理初期能促进NOS的合成，但随着处理时间的延长促进作用越来越减弱，BL复合处理时更加促进了NOS的合成。

图1 氦氖激光与增强UV－B辐射对小麦幼苗根NOS含量的影响Fig.1Influence of He－Ne laser and enhanced UV－B radiation on the content of NOS of the wheat seedling roots

由图1a可知：各不同处理组对NOS含量的影响主要在第5天。对其作方差分析，结果见图1b，其中，CK：对照组；B：单独 UV－B辐射组；L：单独He－Ne激光处理组；BL：He－Ne激光与 UV－B组合处理组。

图1b显示：与对照组（CK）相比，B和L组的NOS含量分别高于对照组28.1%和20.3%（P＜0.01），差异极显著，BL组的NOS含量较B组高4.7%（P＜0.01），差异极显著。这表明：He－Ne激光与UV－B组合处理时，He－Ne激光与UV－B辐射对NOS的含量的影响表现为互为促进作用。

2.2 NR活性的变化

图2a是He－Ne激光与增强UV－B辐射在不同处理天数对小麦幼苗根NR活性的影响。

图2a显示：随着处理天数的延长，各不同处理组小麦幼苗根中NR活性的总体变化趋势均为先升后降然后逐渐趋于稳定且变化趋势相同。从第3天到第4天，4个组的NR活性均有小幅提高，与其它各组相比，B组的变化幅度较剧烈；在第4天时各组的NR活力达到最大值；从第5天到第6天，4个组中NR活性都急剧下降，从第7－10天，各个组中NR活性略有降低，但变化幅度不大，基本保持不变，说明从第7天开始，小麦生长状况比较稳定，体内NR活性比较稳定。

比较4组小麦中NR活性可知：BL组明显高于其他三组，各组NR活性依次为BL组＞L组＞CK组＞B组。对其进行双因素方差分析，可得各处理组在不同的培养天数下，小麦根中NR的活性差异显著（P＜0.01）。

由图2a可知，处理第4天时各组小麦幼苗根的NR活性最强。对其作方差分析，结果如图2b，其中CK：对照组；B：单独 UV－B辐射B组；L：单独He－Ne激光组；BL：He－Ne激光与 UV－B辐射组合处理组。

由图2b可知：与对照组（CK）相比，B组NR的活性较对照组的低32.399%，差异极显著（P＜0.01）；而L组NR活性较对照组高10.92%，差异极显著，（P＜0.01）；先进行 UV－B辐射再进行氦氖激光处理组（BL）的NR活性为B组的1.01倍，差异极显著（P＜0.01），并明显较对照组（CK）的高68.885，差异极显著（P＜0.01）。

由以上结果可知：增强UV－B辐照和He－Ne激光处理对小麦根中NR活性存在一定的影响。增强UV－B辐射处理后，NR的活性对照组有所减弱，表现出一定的抑制作用；He－Ne激光处理后，该酶的活性有所提高，表现出一定得促进作用；而增强UV－B辐射和 He－Ne激光辐射两者复合处理后，NR的活性高于B组，也高于K组，表现出极明显的促进作用，即增强UV－B辐照和氦氖激光两者复合处理后，不仅仅将B组对其酶活性造成的抑制作用进行了修复，还进一步激发了NR的活性，使其高于对照组的水平。

图2 He－Ne激光与增强UV－B辐射对小麦幼苗根NR活性的影响Fig.2Influence of He－Ne laser and enhanced UV－B radiation on the NR activity of the wheat seedling roots

3 讨论

3.1 关于一氧化氮合成酶

3.1.1 NOS与非生物胁迫

研究结果表明：NOS参与植物对非生物胁迫的响应。NOS调节ABA诱导的气孔关闭［12］；NOS能提高植物耐盐性，NOS可能参与离子通道的调控，这可能是耐盐性形成机制之一；重金属胁迫时也可能有NOS的参与［13］，机械损伤能诱导NOS产生NO，H2O2与NO协同作用迅速启动防御系统；NOS也可能参与损伤修复反应。

3.1.2 He－Ne激光和增强UV－B辐射对 NOS含量的影响

NO作为一种调节物质参与植物生长、发育及抵抗生物和非生物胁迫，又作为一种信号分子参与不同的信号转导过程。它在植物的生长发育过程中具有双重作用，因而维持一定的NO水平是很重要的。NOS作为催化NO产生的重要酶之一，也必然在植物逆境胁迫中发挥着重要功能。

UV－B辐射作为一种非生物胁迫，能使植物细胞内活性氧（ROS）水平上升，从而导致氧化胁迫。ROS不仅导致氧化胁迫，还产生了一系列的信号反应。因此，对植物来说调控体内ROS的浓度以适应胁迫环境至关重要。NO具有抗氧化作用，这种抗氧化作用主要依赖于它维持细胞内氧化还原剂平衡和调节ROS毒性的能力［14］。

UV－B辐射后，小麦幼苗根中的NOS含量增加，表明细胞对NOS的需求量增加，随之NOS活性也可能升高。UV－B辐射正是通过增加NOS的含量进而提高NOS的活性诱发小麦幼苗根内NO释放，以达到缓解UV－B辐射造成的氧化损伤。

激光一方面可以直接影响蛋白、酶及生物分子结构，从而导致酶活性的变化；另一方面激光可通过这些酶或直接作用于细胞中DNA，使DNA发生改变，通过转录将信息传给RNA，使转录活动增强，从而产生新的酶或其他蛋白质分子以提高抗逆性。He－Ne激光单独处理后，小麦幼苗根NOS含量增加，可能是激光促进了NOS基因的表达，从而促进了NO的合成。

作为一种信号分子，NO和植物体内的其它激素分子以及ROS都有交互作用，通过调节一些基因表达影响许多生理过程［15］，增强细胞的代谢水平，从而有利于小麦的生长发育。UV－B辐射与He－Ne激光单独处理后，均表现为促进作用，所以复合处理后表现为更强的互为促进的作用。

3.2 关于NR

3.2.1 NR也是植物体内的NO合成酶

植物NR普遍具有合成NO的功能。Rockel等［16］发现向日葵NR和离体菠菜叶片及其脱盐后提取液中的NR，在离体和连体的条件下均具有催化亚硝酸盐单电子还原合成NO的活性。

3.3.2 He－Ne激光和UV－B辐射对NR活性的影响

UV－B辐射后，小麦幼苗根的NR活性下降可能与紫外线会造成植株体内蛋白质的降解有关，一方面使NR的合成受阻，另一方面加速了NR的分解，总的结果是植株体内的NR含量下降，活性降低。另外，NR活性降低，使其合成的NO减少，因此造成了NOS的含量增加来弥补NO的合成，从而抵御紫外线胁迫。激光处理后NR活性升高，可能是激光促进了NR蛋白的合成，含量升高，活性升高，也可能是激光激活了某些钝化的NR的活性，从而表现出活性升高。He－Ne激光与UV－B辐射复合处理后，NR活性高于B组，且高于CK组，这可能是UV－B辐射与He－Ne激光共同作用对NR活性具有激活作用，其具体作用机理还有待进一步的研究。

4 结论

1）经UV－B辐射后，小麦幼苗根中NOS含量显著增多。这一结论和曲颖对豌豆细胞壁的研究结果相似。

NOS是植物体合成NO的主要酶，通过调节NO含量来影响NO作为信号分子在逆境胁迫中的关键作用。这说明小麦幼苗细胞在短时间内通过产生较多的NOS来抵御胁迫，提高小麦在逆境中的生存能力；单独He－Ne激光处理使得NOS含量增多，说明适度剂量的He－Ne激光辐射能够增强植物抵御逆境胁迫的能力，而UV－B辐射后再进行He－Ne激光处理，NOS含量明显增多，说明UV－B和He－Ne激光能够共同协助促进植物对逆境的抵抗。

2）小麦幼苗根中NR的活性在受到UV－B辐射后明显降低，表明UV－B辐射作为一种逆境胁迫，能够阻碍小麦的生长，降低幼苗中NR活性；单独He－Ne激光辐射使得小麦NR活性升高，表明适度剂量的激光辐射能够作为一种诱变因素，增强植物抗逆性，提高NR活性。

3）UV－B辐射后再进行He－Ne激光处理能显著改善NR活性降低的程度。这说明UV－B辐射对小麦幼苗造成的损伤在一定程度上可被He－Ne激光辐射所修复，也就是说He－Ne激光增强了其抵抗UV－B辐射引起损伤的能力。

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Influence of He－Ne Laser Irradiation and UItraviolet－B Radiation on Nitrgen Metabolism Enzymes in Wheat Seedling Roots

LI Suhua，SUN Yongxing，HAN Rong
（SchooI of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041000）

The wheat seedling roots（Linyou 2018）were exposed to He－Ne laser（5mW·mm－2），to the enhanced UV－B radiation（10.08kJ·m－2·d－1）and to the combined He－Ne laser irradiation and enhanced UV－B radiation.3dlater the changes of NOS（nitric oxide synthases）content and the NRA （nitrate reductase activity）of different treatment groups in different trentment time were measured to test the repair role of laser irradiation.The results show that He－Ne laser irradiation can make the content of NOS increase by 4.7%and nitrate reductase（NR）activity increase by 101%，significantly improving the lower degree of nitrate reductase（NR）activity.It suggests that He－Ne irradiation could partially repair the UV－B radiation damage to the nitrogen meatabolism of wheat seedling roots.

UV－B radiation；He－Ne laser；wheat（triticum aestivum）；nitric oxide synthase；nitrate reductase

S512；Q947

A

2011－09－03

国家自然科学基金项目（30671061），山西省自然科学基金项目（2008011059－1）

李素花（1985－），女，硕士生，专业研究方向为植物细胞学；e－mail：lisuhuaky＠163.com。。

韩榕，男，教授，从事环境植物学研究；e－mail：hanrong＠dns.sxnu.edu.cn。