7种肿瘤相关抗原联合检测宫颈癌的价值探讨

王运贤，田淑贞，李留霞，赵 萍

(1.南阳医学高等专科学校妇产科教研室，河南南阳 473061；2.河南省肿瘤医院放疗科，河南郑州 450008；3.郑州大学第一附属医院妇产科，郑州 450052)

宫颈癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，浸润性宫颈癌的5年生存率为67%，早期癌的5年生存率为90%，而原位癌则几乎达100%[1]，因此早期诊断宫颈癌是提高宫颈癌患者生存率的关键。人乳头状瘤病毒(HPV)检测及液基细胞薄层涂片技术(TCT)的应用对提高宫颈癌的早期诊断率发挥了重要作用。近年来研究表明，肿瘤相关抗原(TAAs)在肿瘤尤其恶性肿瘤发生早期即可在肿瘤细胞异常表达而刺激机体免疫系统产生自身特异性抗体[2-3]，检测患者血清中肿瘤自身抗体对早期诊断肝癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤具有重要意义[4-6]。由于宫颈癌病变接近体表，易于通过细胞学检测及宫颈活检确诊，但是宫颈癌病变应具有与其他器官肿瘤相似的生物学特性，肿瘤细胞是否也能刺激机体产生免疫学反应，至今尚未见到有关宫颈癌患者血清TAAs自身免疫抗体检测的报道。本研究拟通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测宫颈癌及癌前病变患者血清中的7种自身抗体，分析各单一抗原及不同抗原组合在宫颈癌患者中检测的阳性率，探讨TAAs在检测宫颈癌方面的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1标本来源 采集2008年7月至2010年7月郑州大学第一附属医院收治的45例宫颈癌患者和40例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的血清标本；40例健康者血清来自健康志愿者和体检检查结果正常的健康成人。所有血清标本均存放于-80 ℃低温冰箱。

1.1.2分组 宫颈癌组：宫颈癌患者术前血清共计45例，患者年龄26～74岁，平均45.02岁。其中腺癌患者7例，鳞癌患者38例。按FIGO临床分期：Ⅰ期癌患者25例，Ⅱ期、Ⅲ期癌患者20例。CIN组：CINⅡ和Ⅲ级患者术前血清40例，患者年龄24～54岁，平均年龄39.87岁。上述两组患者均经病理证实。对照组：健康人血清40例，年龄23～76岁，平均年龄50.97岁。

1.2主要试剂 7种TAAs Koc、CDK2、Survivin、C-myc、p16、CyclinB1和CyclinE均来自美国德州大学生命科学系分子流行病学实验室。Sunrise酶标仪为美国Tecan 公司产品。

表1 单一抗原抗体检测阳性率结果[n(%)]

Sur:Survivin;CycB1:CyclinB1;CycE:CyclinE

表2 不同TAA组合的检测结果的评价[n(%)]

96孔酶标板为Gibico公司产品。其他试剂如四甲基联苯胺(TMB)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(HRP-Aps)等均由郑州大学蛋白质组学应用研究中心实验室馈赠。

1.3方法 采用间接ELISA[7]，各种抗原均以0.5 μg/μL的稀释浓度包被96孔板，4 ℃孵育24 h弃液，3%明胶封闭1 h；一抗待测患者血清以1∶50稀释后每孔加100 μL，磷酸缓冲液 (PBS)作为空白对照，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；二抗HRP-APs以1∶4 000稀释每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；最后每孔加TMB过氧化氢尿素显色液100 μL，37 ℃ 避光反应至显色充分后加终止液(10%硫酸)每孔50 μL，立即在自动酶标仪上读取450 nm OD值，空白孔调零。结果判定：每份待测血清做两孔取其平均值，以健康人血清OD的平均值加2个标准差作为界值即截断值(Cut off)，高于此值判为阳性，低于此值判为阴性。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件进行分析，采用χ2检验分析各组中阳性表达率，均以α=0.05为检验水准，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1单独检测一种抗原抗体的阳性率结果 单独检测血清中一种抗原抗体，在45例宫颈癌患者中阳性率为22.2%～53.3%，以Koc为最高，p16最低；40例CIN患者中阳性率为10.0%～30.0%,以Koc为最高，CDK2最低；对照组阳性率均相应的低于宫颈肿瘤组，见表1。

2.2不同抗原组合的检测结果及诊断宫颈癌的真实性评价 随着TAA组合种类的增加，宫颈癌诊断的灵敏度上升到73.3%，明显高于健康人；而特异度也达到82.5%，仅降低了12.5%，阳性预测值和阴性预测值也达82.5%和73.3%，约登指数(灵敏度+特异度-1)为0.558，阳性似然比[灵敏度/(1-特异度)]为4.18，见表2。

2.37种TAAs检测结果 检测结果显示宫颈癌组、CIN组和对照组的阳性率存在总体差异(χ2=26.590，P<0.05)，两两比较结果，宫颈癌组阳性率明显高于CIN组，两组间差异有统计学意义(χ2=7.083、P<0.05)；宫颈癌组、CIN组阳性率均高于对照组，差异有统计学意义(χ12=26.498，P1<0.05；χ22=7.040，P2<0.05)，见表3。

2.47种TAAs检测宫颈癌的阳性率在组织学类型和临床分期上的差异 7种TAAs检测阳性率在宫颈鳞癌、腺癌之间差异无统计学意义(χ21=0.650，P1>0.05)；CIN与宫颈癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期间差异均有统计学意义(χ12=4.539，P1<0.05；χ22=4.848，P2<0.05)；宫颈癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期间差异无统计学意义(χ2=0.051，P>0.05)，见表4。

表3 7种TAAs联合检测结果

表4 不同病理类型和临床分期检测的结果

3 讨 论

有研究发现，肿瘤患者血清中存有各种类型的抗肿瘤细胞抗原抗体[8]，肿瘤相关抗原抗体系统作为肿瘤早期诊断的分子标志物已成为国内外肿瘤研究领域的热点。对不同肿瘤的研究显示，单一抗原检测某一肿瘤自身抗体时阳性率较低，敏感度和特异度难以满足临床需要[9]，联合检测一组精心挑选的抗原抗体可以提高肿瘤早期诊断的灵敏度，同时为使抗原联合检测在临床应用中达到一定的真实性，不同类型的肿瘤可能需要不同的抗原抗体组合[10-11]。Survivin、p16、CyclinE、CDK2等蛋白均已被证实与宫颈癌的发生、发展、浸润转移相关[12-15],它们在内在性质、作用环节、作用机制上不完全相同，但存在内在关联，可协同促进肿瘤的发生、发展和浸润转移，有一定的联合基础。

本研究用7种TAAs检测宫颈癌，单独检测1种抗原抗体时灵敏度较低，最高的Koc为53.3%，最低的p16为22.2%，说明上述7种抗原单独应用时诊断价值不大。随着TAAs组合种类增加，诊断的灵敏度从22.2%上升到73.3%，增加了51.1%，而特异度从95.0%下降到82.5%，只降低12.5%。总体看，7种TAA微阵列检测结果较为理想，阳性和阴性预测值也达82.5%和73.3%，约登指数0.558，阳性似然比4.18，提示7种TAAs联合检测宫颈癌具有一定的临床价值。检测45例宫颈癌患者及40例CIN患者血清中TAAs抗体，宫颈癌组阳性率明显高于CIN组，两者间差异有统计学意义 (P<0.05)，且宫颈癌组、CIN组血清抗体阳性率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.5)，提示7种TAAs联合检测对宫颈癌的诊断具有一定的参考价值，且说明在宫颈癌前病变期患者血清中已存在TAAs自身抗体的变化，可对宫颈癌的早期诊断起到预警作用。进一步研究显示，CIN组与宫颈癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期间阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)，但是宫颈癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期间差异无统计学意义(P>0.05)，说明7种TAAs检测阳性率与宫颈癌的期别无相关性，与癌变具有相关性，提示血清中免疫学变化在肿瘤发生早期已出现，该检测方法对宫颈癌的早期诊断具有一定参考价值。另外，分析不同病理类型的宫颈癌TAAs检测结果显示，鳞癌与腺癌之间差异无统计学意义，说明7种TAAs检测阳性率与宫颈癌病理类型无明显相关。

综上所述，本研究运用ELISA方法检测宫颈肿瘤患者血清中的自身抗体，获得了较有价值的结果，提示TAAs在早期诊断宫颈癌方面可能具有一定参考价值。

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