TGF-β1对白血病KG-1细胞株Gli1表达的影响

李 哲，潘 静

(辽宁医学院附属第一医院血液科，辽宁锦州 121000)

Hedgehog(HH)信号通路在组织的损伤与修复中可以促使正常干细胞自我更新，因其过度激活可诱使正常干细胞向肿瘤干细胞转化，并最终导致肿瘤的发生[1]，近年来备受关注。最近的研究认为，HH信号通路是白血病干细胞所需的功能性通路，这一通路的失活将阻碍白血病的进展[2]。

Gli是HH信号通路的最后效应阶段，一直以来 Gli 都作为 HH 通路的下游基因参与肿瘤发生。最近关于Gli非经典激活机制的研究表明，Gli 分子可能是几种信号通路所共同整合交织的平台，多种机制可以调控Gli的活性[3]。最近研究表明，在正常成纤维细胞和角质形成细胞以及多种肿瘤细胞系，Gli不仅受HH/Smo信号的调控，也受其他途径的调控，比如TGF-β信号转导通路，这种调控是独立于Ptch/Smo途径的[4]。TGF-β作为非常重要的肿瘤抑制因子，对多种恶性肿瘤细胞的增生有明显的抑制作用。James等[5]研究证实，TGF-β对白血病细胞的增生具有抑制作用，可以诱导白血病细胞分化成熟，而在急性白血病患者中TGF-β水平降低，促使肿瘤细胞过度增生，对急性白血病的发生起促进作用。

为了寻找白血病治疗的新的靶点，笔者假设在白血病中同样存在有TGF-β信号通路对Gli的调控，进行了TGF-β1对KG-1细胞Gli1表达影响的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 KG-1细胞由中国医学科学院血液研究所惠赠。细胞培养应用20%胎牛血清的IMDM培养基，培养环境为5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2仪器与试剂 重组人细胞因子TGF-β1(Pepro Tech)；SIS3(Merck Company)；PCR引物合成(大连宝生物公司);RT-PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司)；Real Time RT-PCR试剂盒(TaKaRa Japan)；Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪(德国Qiagen公司)；凝胶成像系统(美国Syngene公司)。

1.3方法

1.3.1Real Time PCR检测KG-1细胞Gli1 mRNA的表达 cDNA合成：所培养的KG-1细胞总RNA的提取按照Trizol Reagent说明书进行操作，按逆转录试剂盒(Promega公司)说明书进行逆转录合成cDNA。反应体系如下:5×RT缓冲液2 μL，dNTP Mixture(10 mmol)1 μL，Random Hexamer Primer 0.5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL) 0.5 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，实验样品RNA 1 μL，RNase Free H2O 4.5 μL，于25 ℃静置10 min,45 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

Real Time PCR反应体系及反应参数：采用SYBR Prem ix Ex TaqTMKit(TaKaRa公司)进行定量PCR,反应体系如下:SYBR Primx Ex Taq12.5 μL,PCR Forward Primer(10 μmol)0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol)0.5 μL,cDNA 2 μL,dH2O 9.5 μL，总体积25 μL。反应条件如下：95 ℃ 1 min预变性1次，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环反应40次。待测样品每管重复3次。在Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪(德国QIAGEN公司)上进行。PCR引物的序列,Gli1(sense 5′-CCC AAT CAC AAG TCA GGT TCC T-3′,antisense 5′-CCT ATG TGA AGC CCT ATT TGC C-3′),ABL(sense 5′-CGA GAG CCT GGC CTA CAA CAA-3′,antisense 5′-CTA GCA GCT CAT ACA CCT GGG ACA-3′)。采用Comparative Delta-delta Ct法计算Gli1的表达。

1.3.2PCR反应判定KG-1细胞是否表达Ptch和Smo 提取KG-1细胞的mRNA进行反转录，并应用Ptch和Smo的引物进行扩增，PCR引物的序列,Ptch(sense 5′-CTG TTG GCA TAG GAG TGG AGT TCA CC-3′,antisense 5′-CTG CTG GGC CTC GTA GTG CCG AAG C-3′),Smo(sense 5′-CAG AAC ATC AAG TTC AAC AGT TCA GGC-3′,antisense 5′-ATA GGT GAG GAC CAC AAA CCA AAC CAC ACC-3′),反应体系如下:10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(10 mmol)0.5 μL,上游特异性引物(5 μmol)0.5 μL,下游特异性引物(5 μmol)0.5 μL,Taq mix DNA polymerase 0.5 μL,RT产物2.5 μL,ddH2O 18 μL,总体积25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35循环；72 ℃ 5 min。反应结束后，取10 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件：电流160 mA，电泳25 min后，并通过凝胶图像分析仪观察是否有相应的PCR产物。

1.4统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析，组间比较用单因素方差分析，多个样本的均数比较用LSD方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TGF-β1对KG-1细胞Gli1表达的影响 0.1 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞6、12、24 h后，Real Time-PCR结果显示KG-1细胞的Gli1表达与对照组相比没有明显变化；而1 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞6、12、24 h后，Real Time-PCR结果显示,KG-1细胞的Gli1表达与对照组相比，明显低于对照组；而且随作用时间的延长，作用更加明显；1 ng/mL TGF-β1和10 ng/mL TGF-β1对KG-1细胞Gli1表达的影响没有明显差异，因此，后续实验应用两组间近似平均浓度5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞,见图1。

*：与对照组相比，P<0.05。

图1不同浓度TGF-β1作用于KG-1细胞后不同时间Gli1的mRNA表达变化

2.2TGF-β1、SIS3对KG-1细胞Gli1表达影响 因1～10 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞后可引起Gli1的表达减少，且1 ng/mL TGF-β1组和10 ng/mL TGF-β1组之间没有明显差异，故应用其近似平均值5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞，Real Time-PCR结果显示，5 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞24 h，Gli1 的mRNA及蛋白表达较对照组明显降低；Western blotting结果显示，5 ng/mL TGF-β1联合5 μmol SIS3作用于KG-1细胞24 h后，其Gli1的mRNA及蛋白表达较对照组明显增高，见图2。

A：TGF-β1组Gli1 mRNA表达较对照组降低；TGF-β1联合SIS3组Gli1 mRNA表达较对照组明显增高。*：P<0.05，与空白对照组相比。B：TGF-β1组Gli1蛋白表达较对照组降低；TGF-β1联合SIS3组Gli1的蛋白表达较对照组增高。

图2 TGF-β1、SIS3对KG-1细胞Gli1 mRNA和蛋白表达的影响

2.3PCR反应判定KG-1细胞是否表达Ptch和Smo 见图3。

图3 KG-1细胞与对照组的白血病患者相比较，均没有Ptch和Smo基因的表达

3 讨 论

HH基因的作用涉及细胞的增生分化和组织发育。众多研究表明该通路与包括白血病在内的多种肿瘤性疾病相关，因此，抑制该通路有可能成为肿瘤预防和治疗的新靶点。HH信号分子首先作用于受体蛋白Ptch家族，并激活Smo，进而促使 Gli转变成催化剂形式，进入细胞核启动下游基因转录。Gli包括3个同源基因，Gli1、Gli2、Gli3，其中Gli1起激活作用[6]。Gli分子本身与肿瘤细胞的发生、发展并没有直接关系，但直接调控肿瘤细胞增殖、分化、转移的分子基因转录水平则受到HH信号通路调控，可能是该通路导致肿瘤的关键因素。

在造血系统中，HH的家庭成员在体外和体内的干或(祖)细胞扩增中起重要的调节作用。在一些白血病细胞系中对HH信号的成分进行检测，如Ptch和Smo可在Jurkat细胞中表达[7]，Gli1可在HL-60细胞和KG-1细胞中表达，Gli2在KG-1细胞和HL-60细胞中表达[8]。类似于HH信号通路，TGF-β在炎症、组织修复、血管生成和调节细胞生长和分化等复杂过程中发挥了重要作用，其中TGF-β1生物活性最为强，在造血调控方面起重要作用[9]。

虽然有许多的研究表明，HH通路的异常活化在许多恶性肿瘤里存在，但在结肠癌细胞系的研究却发现很多HH通路的关键分子并没有检测到表达，表明在结肠癌细胞系中没有HH通路普遍激活[10]。这表明HH通路所激活的一些靶基因可能同样被其他通路所调控。最近的研究表明，TGF-β通路可以调控Gli的功能[11]，也就是说存在由TGF-β通路调控的HH信号传导通路的非经典调控途径。为了证明在白血病中同样存在由TGF-β通路介导的HH通路的调控，笔者进行了目前的研究。

本研究选取的KG-1细胞株属于急性髓系白血病细胞，有研究表明在这种白血病细胞上存在HH信号转导通路中Ptch和Smo分子的缺失，而Gli则有表达[12]。对于这类细胞传统的阻断HH通路的做法将不起作用，但是因为存在Gli的表达，因此，阻断Gli的表达将可能成为治疗急性白血病的方法之一。对于阻断Gli的表达，特异性的siRNA可以起作用，但是对于白血病细胞，siRNA干扰往往比较困难。本研究应用TGF-β1成功地减少了KG-1细胞Gli1的表达。本研究结果显示，1～10 ng/mL TGF-β1作用于KG-1细胞后的24 h内，Gli1的表达较对照组明显减少，且较少程度随作用时间的延长而显著，但是1 ng/mL TGF-β1组和10 ng/mL TGF-β1组之间没有明显差异。分析TGF-β1降低KG-1细胞的Gli1表达的机制，TGF-β1下游的信号是Smad2和Smad3。对于成人，Smad3是TGF-β1最主要依赖的下游信号，而Smad2则在胚胎发育形成时发挥关键作用[13]。因此，本研究应用SIS3[14]，一种特异性的Smad3的阻断剂，来阻断TGF-β1的作用并观察效果，结果表明SIS3可以有效阻断TGF-β1引起的Gli1的表达降低。因为KG-1细胞不表达Ptch和Smo[12]，这一点在本研究中已经验证，所以TGF-β1降低KG-1细胞Gli1的表达，是不依赖于Ptch/Smo这一途径的，而是依赖于Smad3途径的。

综上所述，本研究应用TGF-β1可以降低KG-1细胞的Gli1的表达，其作用机制不依赖于Ptch/Smo这一途径的，而是依赖于Smad3途径的；提示可以应用TGF-β1，并通过Smad3途径调控Gli1基因，作用于其下游与细胞增殖分化有关的基因，进而对白血病起到治疗的作用。

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