NPM1基因在急性髓细胞白血病中的表达及其临床意义

李 明，汤爱萍，余 莉，李慧慧，费 妍

(1.江西省宜春市人民医院血液内科 336000;2.南昌大学第二附属医院血液内科，南昌 330006)

近年来发现，大约46%～62%的急性髓细胞白血病(AML)中存在NPM1第12号外显子的突变，其在血液肿瘤发生中具有始动作用[1]。鉴于突变检测方法复杂，费用高昂，临床应用受到一定程度限制，因此探寻其基因表达量与AML的关系正成为研究的热点，本研究从基因转录水平层面出发，探讨野生型NPM1表达在AML患者预后判断及微小残留病(MRD)监测的意义，旨在为AML患者提供简便、可靠的分子学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集南昌大学第二附属医院血液科2010年3～9月住院的59例AML患者，所有患者诊断均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[2]。其中，男28例，女31例；中位年龄47.5岁(12～70岁)；初治38例，难治3例，复发3例；完全缓解(CR)期患者15例按FAB分型为M1 1例，M2 31例，M3 19例，M5 6例，M6 2例。同期血液科住院骨髓健康患者15例作为对照组，其中，男7例，女8例；中位年龄40岁(22～61岁)。对于部分患者连续追踪3～4个疗程以进行基因表达的动态监测。

1.2方法

表1 引物

1.2.1治疗方案及疗效标准 AML采用一线化疗方案；急性早幼粒细胞白血病患者采用维甲酸20 mg 2次/日诱导分化治疗，疗效判断均按张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[2]评价。

1.2.2总RNA提取 无菌采集骨髓2～3 mL，淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，应用TRIzol一步法提取细胞总RNA，-80 ℃保存备用。

1.2.3引物(北京三博远志生物技术有限责任公司合成) 见表1。

1.2.4cDNA合成 取总RNA 2 μg，采用EasyScriptTMTwo-Step RT-PCR SuperMix试剂盒进行cDNA合成(北京全式金生物技有限公司，AE401)。

1.2.5PCR反应 反应体系20 μL，cDNA取1 μL，上下游引物各取1 μL，2.5 U/μLTaqDNA聚合酶12.5 μL，焦碳酸二乙酸(DEPC)水7 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃解链1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，33个循环，72 ℃延伸6 min。

1.2.6PCR产物分析 扩增结束后取等量NPM1和GAPDH产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。Quantity One 4.4软件半定量分析，取NPM1/GAPDH比值代表NPM1 mRNA表达水平。

1.3统计学处理 采用SPSS11.0进行统计学处理，以NPM1基因表达量的中位数作为区分NPM1表达水平高低的临界值。经正态性检验，本研究结果中NPM1表达水平为非正态分布，故计量数据以中位数表示，计数资料的两样本率或多个样本率的比较采用χ2检验，两独立样本比较采用秩和检验，相关分析采用秩相关法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1初治AML组、难治复发组、CR组和对照组NPM1表达情况 4组NPM1阳性率之间差异无统计学意义(χ2：2.556；df：2；P：0.279)，详见表2。

表2 不同病期AML患者NPM1阳性率比较

*：与对照组阳性率比较；-：无数据。

2.2不同病期AML患者NPM1表达水平比较 初治和难治复发组NPM1中位表达水平高于CR组及对照组(P<0.05)，难治复发组NPM1中位表达水平高于初治组(P=0.027)，见表3、4，图1。

2.3初治AML患者NPM1表达水平与性别、年龄、外周血白细胞数、骨髓原始幼稚细胞数等临床因素的关系 NPM1强度与外周血白细胞数和骨髓幼稚细胞数呈正相关(P<0.05)，见表5。

表3 不同病期AML患者NPM1表达水平比较

*：与对照组比较；-：无数据。

表4 初治AML患者NPM1表达水平与临床疗效的关系

*：与其他各组比较；-：无数据。

表5 初治AML患者NPM1表达水平与临床因素之间的关系

表6 治疗有效组和无效组之间NPM1表达水平比效

-：无数据。

2.4动态监测NPM1表达 28例初治患者，1个疗程化疗后达CR 19例，PR 6例，NR 3例，治疗后NPM1表达水平均不同程度下降，其中NPM1基因高表达患者12例，4例达CR状态，表达水平降至中位水平以下，监测3个疗程表达水平稳定，随访骨穿目前仍处于缓解状态，1例M5患者初始NPM1表达水平为0.941 7，第1个疗程达CR，监测4个疗程NPM1表达水平不降，持续稳定高表达，中位表达水平为0.828 1(0.769 1～0.941 7)，8个疗程化疗后一直处于CR状态，另外7例NPM1高表达患者治疗后仍持续高表达NPM1基因，为难治性白血病，其中1例一疗程后NR，NPM1表达不降，后继3个疗程达CR，NPM1略高于中位表达水平，第5个疗程临床复发，再次诱导失败，见表6。

1:对照组;2～9：初治AML患者。

图1初治AML患者NPM1 mRNA表达水平

3 讨 论

人NPM1基因定位于5q35[3]，编码的蛋白为核仁磷酸化蛋白。NPM1蛋白主要定位在核仁，可通过核定位信号在核仁、细胞核与细胞质之间往返，参与核质间运输，NPM1在调控周期进程和促进细胞增殖中发挥着重要作用。

通过检测不同来源的白血病细胞中野生型NPMl基因表达水平，有研究显示髓系来源的K562系细胞和75%白血病骨髓细胞均高表达NPMl基因[4]，国内学者何鹏等[5]采用PCR方法分别检测了K562细胞系、THP1细胞系、初治AML患者骨髓和健康人外周血单个核细胞(PBMC)的野生型NPM1基因表达情况，结果显示两种白血病细胞系和5例AML患者骨髓均表达NPM1基因，且强度明显高于PBMC，虽然发现白血病患者骨髓细胞野生型NPM1蛋白含量比健康人高出2～8倍[6-7]，但野生型NPMl基因高表达对白血病细胞的影响研究甚少，在AML中野生型NPM1的表达水平及作用机制以及对疾病的进展、治疗反应等影响尚无定论，基于以上研究，笔者对AML患者骨髓中野生型NPM1基因的表达情况进行了初步研究。

本研究结果显示，野生型NPM1基因不仅在初治及难治复发患者中表达，在CR期和对照组中也存在不同程度的表达，但各组NPM1阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05)，这也与NPM1基因在健康人群中存在广泛生理性表达相符合，需要更深入地了解不同病期AML患者和健康人NPM1基因状态之间的差异。

笔者对各组NPM1基因表达情况进行了分析，结果显示难治复发组患者NPM1中位表达水平高于初治组、CR组及对照组(P<0.05)，且初治组NPM1表达水平高于CR组和对照组，这证实了在初治AML患者骨髓中存在NPM1的高表达现象，而且与患者疾病状态存在一定的联系，对不同NPM1表达水平AML患者的疗效观察也显示，NPM1高表达组治疗有效率低于其他各组(P<0.05)，提示初发时NPM1表达水平高者对化疗反应差、CR率低，在初始治疗时就可以考虑给予较强的化疗方案或逆转耐药治疗；而初发时NPM1水平低者或阴性患者对化疗反应好、易缓解，可给予常规方案，以减少化疗带来的不良反应和并发症，NPM1基因高表达可以为判断预后的一个指标。国外学者通过构建实时荧光定量PCR方法检测了96例AML患者中野生型和突变型NPM1的表达水平[8]，结果显示突变型表达水平高于野生型表达，但差异无统计学意义(P>0.05)，两组表达水平与对照组有显著性差异，也进一步证实了AML患者中存在野生型NPM1基因的异常表达现象。野生型NPM1基因高表达致白血病的机理仍不清楚，根据现有研究表明NPM1高表达主要直接或间接影响P53和可变读框基因(ARF)通路导致白血病的发生。Bard等[9]通过向淋巴母细胞(FA-C)中转染NPM1表达载体提高NPM1表达水平后，可以使PKR激酶活性显著降低，使细胞凋亡数目减少60%，这说明NPM1表达强度的增加可能是FA-C转化成白血病细胞的机制之一。最近的研究还显示[10]，将NPM1过表达的NIH3T3细胞植入裸鼠体内，这些细胞表现出了很强的生长能力和肿瘤生成能力，而且这些细胞中干扰素调节因子-1(IRF-1)的靶基因赖氨酸氧化酶基因表达水平下降，提示NPM1过表达抑制了IRF-1的抗肿瘤作用，以上结合本研究结果提示NPM1表达增强参与了AML的发生和发展过程，但另一方面值得关注的是，个别研究结果也显示[11]当细胞在出现应激状态或DNA损伤时，细胞内NPM1表达水平可增加，能够通过增加P53的稳定性而抑制细胞的增殖并引发细胞凋亡。因此，NPM1基因改变对细胞增殖和凋亡的影响及在AML中的作用还需要进一步深入研究。

本研究也初步探讨了野生型NPM1基因在AML中MRD检测和应用的可行性。依据本研究的结果表明，NPM1表达强度与外周血白细胞数和骨髓原始幼稚细胞数呈正相关(P<0.05)，虽然动态观察结果例数有限，但可以看出，NPM1高表达不降者，除预后差外，而且更易复发，因此，定量分析NPM1基因可以作为MRD的监测指标，但值得注意的是本研究观察到1例AML-M5患者，初诊时NPM1高表达，第1个疗程达CR，NPM1基因表达水平不降，连续追踪4个疗程NPM1表达水平始终稳定在高水平，该患者已完成8个疗程以上化疗，一直处于临床缓解状态，该患者是否存在合并NPM1基因突变可能，野生型NPM1表达与NPM1突变有何种关系尚不清楚，这些都有待进一步研究，因此NPM1高表达作为MRD的监测指标仍应慎重，有待在临床实践中进一步观察和总结。总之，AML患者中存在NPM1基因的异常表达现象，NPM1异常表达与AML的发生及发病有关，其定量分析NPM1基因表达可以作为预后危险分层和白血病微小残留病灶监测的指标之一。

[1]Wertheim G,Bagg A.Nucleophosmin (NPM1) mutations in acute myeloid leukemia:an ongoing(cytoplasmic) tale of dueling mutations and duality of molecular genetic testing methodologies[J].J Mol Diagn,2008,10(3):198-202.

[2]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京：科学出版社，2007：106-112.

[3]Grisendi S,Pandiolfi PP.NPM mutation in acute myelogenous leukemia[J].N Engl J Med,2005,352(3):291-292.

[4]Lindström MS,Zhang Y.Ribosomal protein S9 is a novel B23 /NPM-binding protein required for normal cell proliferation[J].J Biol Chem,2008,283(23):15568-15576.

[5]何鹏,骆展鹏,张伶，等.RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达[J].第三军医大学学报,2008,30(10)：983-941.

[6]Chan PK,Chan FY,Morris SW,et al.Isolation and characterization of the human nucleoposmin/B23(NPM) gene:identification of the YY1 binding site at the 5′enhancer region[J].Nucleic Acids Res,1997,25(6):1225-1232.

[7]Qing Y,Yingmao G,Lujun B,et al.Role

of Npm1 in proliferation,apoptosis and differentiation of neural stem cell[J].J Neurol Sci,2008,266(2):131-137.

[8]Hafez M,Ye F,Jackson K,et al.Performance and clinical evaluation of a sensitive multiplex assay for the rapid detection of common NPM1 mutation[J].J Mol Diagn,2010,12(5):629-635.

[9]Bard JD,Gelebart P,Anand M,et al.Aberrant expression of IL-22 receptor 1 and autocrine IL-22 stimulation contribute to tumorigenicity in ALK+anaplastic large cell lymphoma[J].Leukemia,2008,22(8):1595-1603.

[10]Greulich C,Diendorf J,Gessmann J,et al.Cell type-specific responses of peripheral blood mononuclear cells to silver nanoparticles[J].Acta Biomater,2011,7(9):3505-3514.

[11]Chi HT,Vu HA,Iwasaki R,et al.Detection of exon 12 type A mutation of NPM1 gene in IMS-M2 cell line[J].Leuk Res,2010,34(2):261-262.