姜黄素对肝癌HepG2和Bel-7404细胞增殖的抑制作用

任嫦娥，郭惠萍

(山西省交口县人民医院 1.药剂科，2.消化内科，山西 交口 032400)

原发性肝癌的发病率高，居我国癌症的第二位。我国每年因肝癌而死亡的人数20余万，约占世界肝癌死亡人数的45%［1］。肝癌已经成为严重危害人类健康的恶性疾病。大多数肝癌患者发现时已进入晚期而失去手术时机，化学治疗对肝癌患者尤其是晚期患者仍占重要的地位。但化疗药物不良反应严重、易发生耐药，而影响肝癌的治疗［2］。研究和寻找对肝癌疗效高、不良反应轻的药物是迫切需要解决的问题之一。

姜黄素(curcumin)为姜黄(Curcuma longa)的重要活性成分之一，是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素，具有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老、清除自由基及抑制肿瘤生长等作用［3］，且抗癌谱广，可抑制多种体外建株肿瘤细胞的生长［4-6］。目前，姜黄素对肝癌细胞 HepG2和Bel-7404增殖的影响未见报道。本研究以姜黄素干预肝癌HepG2和Bel-7404细胞，探讨姜黄素的抗肿瘤活性，旨在为姜黄素治疗肝癌提供实验依据。

1 材料

姜黄素(含量＞80%)，美国Sigma公司;RPMI 1640培养基，Gibco公司，新生牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)，Sigma公司;顺铂，山东罗欣药业股份有限公司。

人肝癌细胞株HepG2和Bel-7404，上海细胞资源中心。

SHEL-LAB2300 CO2培养箱，日本三洋工业株式会社;Bio-RAD550全自动酶标仪，美国伯乐公司;Olympus倒置相差显微镜，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2和Bel-7404分别接种于含10%FBS和含1%链霉素、青霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下传代培养下孵育，以0.25%胰蛋白酶消化，细胞呈单层贴壁生长，每1～2 d更换1次培养基，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 分组

空白对照组为含0.2%DMSO的RPMI 1640培养基和细胞;顺铂组为含0.2%DMSO的 RPMI 1640培养基和细胞以及2.5 μg/mL顺铂;姜黄素组共设 5 个浓度组(2.5，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL)，每孔加入相应浓度的姜黄素和含0.2%DMSO的RPMI 1640培养基以及细胞加不同浓度的姜黄素。作用时间均为12，24，48和72 h。

2.3 细胞增殖的检测

采用MTT法检测细胞增殖，将含10%FBS的RPMI 1640培养基稀释至一定浓度后，取对数生长期肝癌细胞HepG2和Bel-7404，分别以3×103/mL的活细胞密度接种于96孔培养板中，体积为200 μL/孔，37℃、5%CO2饱和湿度条件下传代培养下孵育，待细胞贴壁生长后加入不同浓度姜黄素及顺铂溶液，加药量为200 μL/孔，不同加药量设6个平行孔。孵育12，24，48和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培养箱继续孵育4 h后，小心吸去培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡混匀后，用酶标仪测定每孔在490 nm波长处的吸光度(A)值，根据A值判定药物对细胞增殖的影响，并计算细胞生长抑制率(IR)［7］。IR=(1-A实验组/A对照组)×100%。实验重复3次，取平均值。

2.4 统计学方法

数据分析采用SPSS13.0统计分析软件，计量资料采用(±s)表示，计量资料比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用

结果表见1。姜黄素对肝癌细胞HepG2的增殖抑制有量效关系，并呈时间依赖性。在相同作用时间下，与空白对照组比较，2.5，10.0 μg/mL姜黄素对肝癌细胞HepG2的增殖没有明显的抑制作用(P＞0.05)，而 25.0，50.0，100.0 μg/mL 姜黄素以及顺铂组对肝癌细胞HepG2的增殖均有明显的抑制作用(P＜0.05)。

3.2 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞Bel-7404的增殖抑制作用

结果见表2。姜黄素对肝癌细胞Bel-7404的增殖抑制有量效关系，并呈时间依赖性。在相同作用时间下，与空白对照组比较，2.5，10.0 μg/mL姜黄素对肝癌细胞Bel-7404的增殖没有明显的抑制作用(P ＞0.05)，而 25.0，50.0，100.0 μg/mL 姜黄素以及顺铂组对肝癌细胞Bel-7404的增殖均有明显的抑制作用(P＜0.05)。

4 讨论

姜黄素来源丰富，广泛存在于姜科植物姜黄、莪术、郁金以及天南星科植物菖蒲的根茎中。目前姜黄素抗肿瘤活性是国内外研究的热点，其抗肿瘤机制较为复杂，在不同的细胞类型中表现出不同的效应，诱导效应产生的分子机制也不尽相同。目前国内外研究普遍认为姜黄素的抗肿瘤作用机制可能主要与抑制肿瘤细胞的生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡有关［8］，而且是通过抑制核转录因子的活性、调控癌基因、抑癌基因蛋白和凋亡调控蛋白的表达等途径抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［9-10］。姜黄素对大肠癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的化学防护作用已得到部分证实［11-12］。

本研究以不同浓度的姜黄素分别作用肝癌HepG2和Bel-7404细胞，采用MTT法检测姜黄素对肝癌HepG2和Bel-7404细胞增殖抑制作用，结果显示，不同浓度的姜黄素组、顺铂组的A值与空白对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。不同浓度的姜黄素和顺铂作用于肝癌HepG2和Bel-7404细胞后，细胞的增殖受到明显的抑制，并呈剂量-时间关系。特别是25.0，50.0和100.0 μg/mL姜黄素在不同的作用时间对肝癌HepG2和Bel-7404细胞的增殖均有明显的抑制作用(P＜0.05)。表明姜黄素对肝癌HepG2和Bel-7404细胞有较强的体外细胞毒性作用，可以明显的抑制肝癌HepG2和Bel-7404细胞增殖的生长，且存在剂量-时间的关系。姜黄素对肝癌HepG2和Bel-7404细胞增殖的抑制作用为姜黄素抗肿瘤的研究提供了一定的参考。

表1 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞HepG2的影响(±s，n=3)Tab.1 The effect of curcumin on human HepG2 cells at different incubation time(±s，n=3)

表1 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞HepG2的影响(±s，n=3)Tab.1 The effect of curcumin on human HepG2 cells at different incubation time(±s，n=3)

与空白对照组比较:1P＜0.05Compared with the control group:1P＜0.05

组 别 剂量/(μg/mL) 抑制率/%12 h 24 h 48 h 72 h空白对照组-0000姜黄素组 2.5 5.67±1.89 4.43±1.48 2.86±0.95 3.70±1.23 10.0 12.35±4.12 13.72±4.57 14.81±4.94 20.72±6.91 25.0 18.19±6.061 24.15±8.051 29.88±9.961 40.89±13.631 50.0 32.50±10.831 40.83±13.611 49.00±16.331 62.00±20.671 100.0 45.61±15.201 57.37±19.121 69.03±23.011 83.31±27.771顺铂组 2.5 49.67±16.561 65.03±21.681 80.32±26.771 93.85±31.281

表2 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞Bel-7404的影响(±s，n=3)Tab.2 The effect of curcumin on human Bel-7404 cells at different incubation time(±s，n=3)

表2 姜黄素作用不同时间后对肝癌细胞Bel-7404的影响(±s，n=3)Tab.2 The effect of curcumin on human Bel-7404 cells at different incubation time(±s，n=3)

与空白对照组比较:1P＜0.05Compared with the control group:1P＜0.05

组 别 剂量/(μg/mL) 抑制率/%12 h 24 h 48 h 72 h空白对照组-0000姜黄素组 2.5 9.02±3.01 11.98±3.99 8.58±2.86 6.82±2.27 10.0 20.24±6.75 20.66±6.89 17.69±5.90 9.69±3.23 25.0 48.90±16.301 40.12±13.371 31.37±10.461 20.47±6.821 50.0 73.55±24.521 61.08±20.361 52.28±17.431 40.93±13.641 100.0 85.97±28.661 77.84±25.951 69.44±23.151 59.07±19.691顺铂组 2.5 80.96±26.991 74.25±24.751 64.61±21.541 57.99±19.331

［1］ 吴孟超.原发性肝癌的诊断及治疗进展［J］.中国医学科学院学报，2008，30(4):363-365.

［2］ 汪多平，欧 超，段小娴，等.肝细胞癌组织PTEN和Cyclin D1及c-myc表达的临床病理意义［J］.中华肿瘤防治杂志，2009，16(7):519-522.

［3］ 黄燕芬，袁小凤.姜黄素水解衍生物对肝癌细胞增殖和凋亡调控因子的影响［J］.中华中医药学刊，2008，26(8):1757-1759.

［4］ Iyer P，Zekri A R，Hung C W，et al.Concordance of DNA methylation pattern in plasma and tumor DNA of Egyptian hepatocellular carcinoma patients［J］.Exp Mol Pathol，2010，88(1):107-111.

［5］ 滕 达，王 婷，陈复兴，等.姜黄素增强γδT细胞对神经胶质瘤细胞U251杀伤作用的机理［J］.中国生化药物杂志，2011，32(3):194-197.

［6］ 覃 勇，傅仲学，卢伟东，等.姜黄素逆转人结肠癌细胞株HCT-8/VCR多药耐药的研究［J］.中国生化药物杂志，2011，32(3):173-175.

［7］ 黄宏思.黄芪多糖协同抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用［J］.中国现代临床医学，2007，6(4):35-37.

［8］ Manoharan S，Balakrishnan S，Menon V P，et al.Chemopreventive efficacy of curcumin and piperine during 7，12-dimethylbenz［a］anthracene-induced hamster buccal pouch carcinogenesis［J］.Singapore Med J，2009，50(2):139-146.

［9］ 谭小平，徐三平，何长华，等.姜黄素诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用机制［J］.肿瘤研究与临床，2007，19(4):225-227.

［10］赵东利，谢小卫，李明众，等，姜黄素对S180小鼠体内抗肿瘤作用的实验研究［J］.西安交通大学学报:医学版，2007，28(1):70-73.

［11］单路娟，郭慧淑，刘越坚.姜黄素对肝癌细胞株SMMC7721凋亡的研究［J］.大连医科大学学报，2009，31(2):142-144.

［12］霍红梅，张利元，江家贵，等.姜黄素抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其相关的氧化应激机制［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(5):490-493.