乳糖诱导胸腺融合肽Tα1-TP5在大肠杆菌中的表达

谢 琦，李 娟，王凤山

(1.桂林医学院 生物技术学院，广西 桂林 541004;2.山东大学 药学院生化与生物技术药物研究所，山东 济南 250012)

胸腺五肽(TP5)是一种免疫调节活性较强的多肽药物，但它较短的半衰期(30 s)影响了其疗效的发挥［1］。胸腺素 α1(Tα1)具有与 TP5相似的生物活性与临床用途，其血浆半衰期(t1/2)长达1.5 h［2］。为了快速、大量获得在活性和稳定性方面都优于TP5和Tα1的多肽药物，我们构建了与GST基因融合表达的胸腺融合肽Tα1-TP5表达菌株，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下实现了高效可溶性表达［3］。

IPTG作为乳糖类似物，是一种高效的重组蛋白表达诱导剂，但它对人体具有潜在的毒性［4］，而且价格昂贵，使其在基因工程药物大规模生产中的应用受到限制。乳糖是一种有潜力的可以替代IPTG的诱导剂，乳糖进入细胞后经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖，进而起到诱导剂的作用［5-6］。乳糖没有毒性且价格低廉，用乳糖替代IPTG已成为目前研究的热点。本研究以乳糖作为诱导剂，在摇瓶发酵条件下研究了不同培养基、诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和诱导方式对目的肽Tα1-TP5表达的影响，旨在为实现Tα1-TP5低成本、高产量的大规模生产奠定基础。

1 材料

含pGEX-4T-1/Tα1-TP5重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，由山东大学药学院生化与生物技术药物实验室构建。

酵母粉、蛋白胨、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)，BBI公司;IPTG，Merck公司;其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 培养基的配制

LB培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，121℃灭菌20 min;TB培养基:酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氢钾17 mmol/L，磷酸氢二钾72 mmol/L，高压灭菌时磷酸盐与其它组分分开，待溶液冷却至60℃以下后混合。

2.2 工程菌培养

原始冻干菌种室温自然解冻后，接种于新鲜的含50 g/mL氨苄西林(Amp)的固体LB或TB培养基中，37℃培养过夜，再挑单菌落转接于新鲜的液体培养基中，37℃，220 r/min培养。

2.3 菌体生长及目的蛋白表达量的测定

菌体生长量以A600值表示。诱导表达结束后，取菌液1 mL，离心收集菌体，加入1×上样缓冲液200 μL 混匀，100 ℃加热 5 min，12 000 r/min 离心2 min，取上清 10 μL，行 12%SDS-PAGE 电泳，AlphaEase凝胶电泳图像分析系统分析各样品所含目的蛋白的比例。

2.4 GST-Tα1-TP5融合蛋白可溶性表达的测定

诱导表达结束后，取菌液1 mL，离心收集菌体，加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，超声破菌后，12 000 r/min离心10 min，分别取上清及沉淀，行12%SDS-PAGE电泳。

2.5 不同培养基对目的蛋白表达的影响

按2.2项下方法，将工程菌分别接种于含Amp的LB及TB培养基中，在诱导时间、温度、乳糖浓度相同的条件下进行诱导表达，检测目的蛋白表达量。

2.6 诱导时机对目的蛋白表达的影响

根据2.5项的实验结果，TB培养基更有利于目的蛋白的表达，以下实验均使用TB培养基。

按2.2项下方法进行工程菌培养，分别以0.5%的接种量，转接于装有TB培养基100 mL的锥形瓶中，37℃振荡培养，在菌体生长进入对数生长期的前、中、后期，即菌液 A600值分别为 0.5，0.9，1.4 时加入乳糖，使其终浓度为2 g/L，在诱导时间、温度、乳糖浓度相同的条件下进行诱导表达，检测目的蛋白表达量。

2.7 诱导温度对目的蛋白表达的影响

按2.2项下方法进行工程菌培养，在诱导时间、乳糖浓度、转速等条件相同的情况下，置不同温度(25，30，37℃)的摇床中进行诱导表达。检测目的蛋白表达量，检测最佳诱导温度下目的蛋白的可溶性表达情况。

2.8 诱导剂浓度对目的蛋白表达的影响

按2.2方法进行工程菌培养，至最佳诱导A600值，分别加入不同浓度的乳糖诱导剂，使其终浓度为0.5，1，2，3，5 g/L，在最佳诱导温度下培养 6 h，检测目的蛋白表达量。

2.9 诱导时间对目的蛋白表达的影响

按2.2项下方法进行工程菌培养，至最佳诱导A600值，在最佳诱导浓度下诱导表达。从诱导开始起每1 h取菌液1次，检测目的蛋白表达量。

2.10 诱导方式对目的蛋白表达的影响

按2.2项下方法进行工程菌培养，至最佳诱导A600值，分别按一次性或分批的方式加入诱导剂。一次性的方式为一次性添加最佳诱导浓度的量;分批的方式为自诱导始，每隔1 h添加一次乳糖，添加量为最佳量的1/4，共添加4次。两种方式的诱导时间均为6 h。检测目的蛋白表达量。

2.11 乳糖诱导和IPTG诱导效果的比较

按实验优化的乳糖诱导的最佳条件进行目的蛋白的表达，与相同条件下，1 mmol/L IPTG诱导的结果进行比较，评判乳糖诱导的效果。

3 结果

3.1 不同培养基对目的蛋白表达的影响

在其它诱导条件相同的情况下，工程菌在TB培养基中目的蛋白的表达量较高。SDS-PAGE电泳后经AlphaEase软件分析，TB培养基比LB培养基中目的蛋白的表达量高，为总蛋白的32.5%。结果见图1。

图1 目的蛋白在不同培养基中的表达情况Fig.1 Expression of target protein in different culture media

3.2 诱导时机对目的蛋白表达的影响

结果表明，在发酵时间相同的条件下，在菌体生长期的各个阶段加入乳糖均有目的蛋白的表达。比较而言，在菌体对数生长期的后期(A600约为1.4)进行诱导，目的蛋白的表达量最高，但只是略高于中期(A600约为0.9)，明显高于前期。说明在对数生长的早期诱导不利于目的蛋白的表达。实验表明，在菌体对数生长的中后期一个较宽的时间范围内诱导，目的蛋白的表达量变化不大，这个特性有利于大规模重组产物的生产控制。结果见图2。

图2 不同时期诱导目的蛋白表达的情况Fig.2 Expression of target protein in different induction time

3.3 诱导温度对目的蛋白表达的影响

在其它诱导条件相同的情况下，37℃时，目的蛋白的表达量最高(图3)。通过测定在37℃时目的蛋白的表达形式，可知主要以可溶的方式表达(图 4)。

3.4 诱导剂浓度对目的蛋白表达的影响

结果显示，终浓度为0.5 g/L的乳糖即可诱导目的蛋白的表达，当乳糖浓度达到1 g/L时可获得35%的目的蛋白的表达量。说明工程菌对乳糖的诱导效应是十分敏感的，较低浓度的乳糖即能启动目的基因的高效表达。乳糖浓度达到1 g/L后，目的蛋白的表达量不再随乳糖浓度的增加而增加。所以对此工程菌而言，乳糖的最佳诱导浓度是1g/L。见图5。

3.5 诱导时间对目的蛋白表达的影响

结果显示，加入乳糖后，目的蛋白的表达随着诱导时间的增加而增加，至6 h达到最高，之后不再随时间的增加而增加。故乳糖的最佳诱导时间为6 h。见图6。

图3 目的蛋白在不同诱导温度下的表达情况Fig.3 Expression of target protein at different induction temperatures

图4 目的蛋白的表达形式Fig.4 Expression form of target protein

图5 不同浓度乳糖的诱导结果Fig.5 The target protein expression induced by lactose at different concentrations

图6 诱导时间对目的蛋白表达的影响Fig.6 Effect of induction time on the expression of target protein

3.6 诱导方式对目的蛋白表达的影响

结果显示，一次性添加乳糖诱导的方式与流加乳糖诱导的方式对目的蛋白的表达量的影响无明显差异，见图7。从有利于操作的角度出发，一次性添加的方式更简便。

图7 诱导方式对目的蛋白表达的影响Fig.7 Effect of induction modalities on the expression of target protein

3.7 乳糖诱导和IPTG诱导效果的比较

结果显示，在乳糖诱导的最佳条件下目的蛋白的表达可达到IPTG的诱导效果，见图8。

图8 不同诱导剂对目的蛋白表达的影响Fig.8 Effect of different inducers on the expression of target protein

4 讨论

含有乳糖操纵子的表达系统是目前应用最广泛的重组蛋白表达系统。IPTG是乳糖操纵子高效的诱导剂，其在大肠杆菌中不被降解和代谢，诱导条件简单，诱导浓度低，诱导效果持久。但由于它对人体潜在的毒性，当利用IPTG诱导表达应用于人体的基因工程药物时，有可能对产品带来一些不利的影响，而且IPTG的价格昂贵，在大规模的工业化生产中应用必然会造成发酵成本的增加，所以通常只作为实验室表达少量蛋白质时的诱导剂。乳糖作为原核细胞的常用碳源，对乳糖操纵子具有天然的诱导作用，但由于乳糖可以被菌体代谢利用，同时，作为一种糖类物质，它的存在必然会引起细胞在转运以及生理代谢等方面的一系列复杂变化。与IPTG相比，利用乳糖为诱导剂其诱导过程更复杂，诱导条件需要更深入地研究和优化。尽管如此，乳糖以其无毒、价廉的优点，使其在重组基因工程药物的大规模发酵生产中具有优于IPTG的潜在价值和优势。

本文以乳糖代替IPTG作为诱导剂，对影响菌体生长和目的产物表达的培养基组成、诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和诱导方式等因素进行了深入的研究，从中分析并寻找适合工程菌生长和目的产物诱导表达的条件。结果表明，TB培养基比LB培养基更有利于工程菌的生长和目的产物的表达，这主要是因为TB培养基比大肠杆菌常用的LB培养基营养更丰富，此外TB培养基中的甘油作为碳源，使得菌体生长过程中不会产生乙酸，利于重组蛋白的积累，而磷酸盐中的钾离子能够维持细胞渗透压，磷酸根能保持菌体生长过程中稳定的pH。乳糖终浓度为1 g/L时即可诱导目的蛋白的高效表达，成本不足IPTG诱导的15%。在菌体对数生长的中后期诱导有利，推测是因为乳糖转运是一个主动运输的过程，需要一系列酶的参与，因而需要一定的生物量和透过酶的表达作为目的蛋白诱导表达的基础，所以在菌体对数生长的中后期诱导更有利于目的蛋白的表达。此外，最佳诱导温度为37℃，最佳诱导时间为6 h，分批流加乳糖4次和一次性加入乳糖诱导目的蛋白表达量无明显差异。在优化后的条件下，乳糖诱导的GST-Tα1-TP5融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的35%，且主要以可溶形式表达，与IPTG的诱导效果无明显差异。在随后的研究中，乳糖将作为诱导剂应用于高密度发酵过程。这些研究结果不仅为实现胸腺融合肽Tα1-TP5的工业化生产奠定了基础，而且也可为其它由乳糖操纵子调控的重组基因工程药物的工业化生产提供有益的参考和借鉴。

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