EPA、DHA对脂多糖刺激大鼠系膜细胞表达MMPs、TIMPs及 TGF-β1的影响

赵 辉，胡晓晶，柳方娥，程艳娜，焦 波

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东大学 第二医院，山东 济南 250033)

肾脏疾病如IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)、肾小球肾炎等是常见的原发性肾小球肾炎。20%～40%IgAN患者20～25年后进展至终末期肾功能衰竭。IgAN发病过程中，有多聚IgAl(pIgAl)沉积，IgA沉积于系膜区将引起肾小球炎症和损伤，但其后续的炎症及小管间质改变与其他慢性肾脏疾病的进展并无明显差异。一些生长因子如转化生长因子(TGF-β1)等与IgAN的病情进展有着十分密切的关系［1-2］。疾病进展过程中细胞外基质(ECM)代谢失衡，其合成增多或降解减少导致的ECM蛋白组分过度积聚是肾小球硬化的主要病理特征。目前对IgAN无特异性治疗药物，有报道鱼油对IgAN可减轻蛋白尿、改善肾脏损害，其治疗作用呈剂量依赖性［3］。

鱼油是从深海鱼类提取，含丰富的ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA)，其主要活性成分是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。鱼油除具有抗血栓、舒血管、调血脂、抗肿瘤等作用外，还具有一定的肾脏保护作用，延缓肾脏疾病的进展［4-7］，但其机制目前还不十分清楚。我们前期研究证实EPA和DHA可明显抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖并促进其凋亡［8］，提高 GMC 抗氧化酶活性［9］，对损伤的GMC有一定的保护作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一组参与 ECM降解的关键酶系，几乎能降解所有 ECM蛋白组分［10］。金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)是MMP内源性抑制剂，可特异性地抑制MMP的表达与活性［11］。本研究进一步观察 EPA、DHA对 LPS刺激的 GMC表达MMP、TIMP及 TGF-β1的影响，以研究其肾脏保护机制。

1 材料

GMC，武汉大学中国典型培养物保藏中心;胎牛血清(FBS)，杭州四季青公司;RPMI 1640，Solarbio公司;LPS、EPA、DHA，Sigma公司;RNA 提取、逆转录及PCR试剂盒，TaKaRa公司;引物，上海博尚合成;TGF-β1酶免试剂盒，ADL公司。

2 方法

2.1 MMP-2和MMP-9活性测定

GMC在含0.5%FBS的RPMI 1640培养液中培养24 h后，随机分为正常对照组、模型组(LPS 10 mg/L);EPA(10，100 μmol/L，含 LPS 10 mg/L)组、DHA(10，100 μmol/L，含 LPS 10 mg/L)组，无血清培养48 h后，离心收集细胞上清液，取上清上样于含0.1%明胶的8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(SDSPAGE);电泳结束后将胶体置于洗脱液(2.5%Triton X-100)中震荡洗涤;放入明胶缓冲液(50 mmol/L Tris，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2，pH 7.5)，37 ℃ 孵育18 h;用水漂洗凝胶，置24℃恒温摇床中考马斯亮蓝染色4 h，再用水漂洗，将漂洗后的凝胶置于凝胶成像仪下扫描条带，分析MMP活性。

2.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 的 mRNA表达检测

细胞培养及分组同2.1项。GMC培养48 h后，收集细胞，按照试剂盒抽提细胞总RNA，并测定总RNA含量。按逆转录反应体系10 μL中加RNA 0.5 μg计算，取 RNA 0.5 μg 逆转录成 cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参照，用实时定量PCR方法进行 PCR扩增。MMP-2上游引物5'-TTTGTTTGCCCTTTGCTGTTTG-3'，下游引物 5'-AGCCGATGACTTGGTTCTCC-3'，产物 198 bp;MMP-9 上游引物5'-CCTACTGCTGGTCCTTCTGAG-3'，下游引物5'-TTGGCTTCCTCCGTGATTCG-3'，产物 159 bp;TIMP-1上游引物5'-TCCTGGTTCCCTGGCATAATC-3'，下游引物 5'-CAAGCAATGACTGTCACTCTCC-3'，产物137 bp;TIMP-2上游引物5'-TGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3'， 下 游 引 物 5'-TGCTGAAGAGGGGGCCGTGTAGAT-3'，产物 210 bp;GAPDH上游引物5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游引物5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'，产物308 bp。各种引物使用前均稀释为10 μmol/L。PCR反应体系为20 μL，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环，反应在ABI Prism 7000 sequence detector(ABI公司)中进行。采用实时荧光定量PCR相对定量分析方法(2-△△Ct法)进行分析:△△Ct=［Ct(实验组基因)-CtGAPDH(实验组基因)］-［Ct(对照组基因)-CtGAPDH(对照组基因)］，2-△△Ct表示实验各处理组目的基因mRNA的相对表达量。

2.3 ELISA法检测细胞培养上清中TGF-β1的含量

分组同2.1项。各组分别培养48 h后，离心收集细胞上清液，参考试剂盒说明书检测 TGF-β1含量。结束反应后，于450 nm波长处检测定吸光度值。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 EPA、DHA对LPS刺激的大鼠肾小球系膜细胞MMP-2、MMP-9活性的影响

见图1。由图1可知，用LPS刺激后，细胞培养液中MMPs活性有所降低，EPA和DHA可以提高MMP活性(P＜0.05)。

3.2 EPA、DHA对LPS刺激的GMC MMP和TIMP mRNA表达的影响

LPS刺激GMC后，细胞表达MMP mRNA明显降低，TIMPmRNA明显增高，MMP-2/TIMP-2以及MMP-9/TIMP-1比值明显降低。经EPA和DHA作用后，MMP、TIMP mRNA表达呈现一定抑制作用，但MMP-2/TIMP-2以及 MMP-9/TIMP-1比值明显升高。见表1～2。

图1 EPA、DHA对LPS诱导的GMC MMP-2和MMP-9活性的影响Fig.1 Effects of EPA and DHA on the activity of MMP-2，9 in GMC induced by lipopolysaccharide

3.3 EPA、DHA对 LPS刺激GMC产生 TGF-β1蛋白含量的影响

LPS刺激GMC后，细胞分泌TGF-β1含量显著升高，加入EPA、DHA后，上清液中TGF-β1含量显著降低。见表3。

4 讨论

GMC是肾小球固有细胞中功能最活跃的细胞［12］。生理状态下，GMC行使收缩、吞噬及维持ECM代谢平衡等各种功能。病理状态下，各种刺激因素诱导的GMC增殖及ECM积聚，是肾小球疾病进展的基本病理过程。肾小球ECM主要蛋白组分包括Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等。ECM合成增多或降解减少导致的ECM过度积聚，是各种肾病发展至肾小球硬化的共同病理表现。许多蛋白酶可以降解ECM蛋白组分，而MMP是一组最重要的ECM降解酶系［13］。TIMP是MMP的内源性特异性抑制剂，通过与MMP催化活性中心的Zn2+结合而封闭其催化活性，抑制其对特异性ECM蛋白的降解。肾组织主要表达MMP-2、MMP-9及其特异性抑制剂TIMP-2、TIMP-1，参与调节生理及病理状态下ECM代谢平衡。当经典炎症刺激物LPS刺激GMC后，GMC 出现异常增殖［8，14］，合成 ECM 蛋白组分增加。MMP、TIMP作为调控ECM代谢的关键酶系，其表达可能存在紊乱，酶活性降低。

表1 EPA、DHA对LPS刺激GMC MMP-2/TIMP-2 mRNA表达的影响(±s，n=3)Tab.1 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-2/TIMP-2 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表1 EPA、DHA对LPS刺激GMC MMP-2/TIMP-2 mRNA表达的影响(±s，n=3)Tab.1 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-2/TIMP-2 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

与LPS组比较:1P＜0.05，2P＜0.01Compared with LPS group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

组 别 浓度/(μmol/L)MMP-2 TIMP-2 MMP-2/TIMP-2 LPS组-0.71±0.08 1.68±0.04 0.43±0.06 EPA组 10 0.66±0.03 1.10±0.162 0.60±0.101 100 0.51±0.041 0.66±0.032 0.78±0.043 DHA组 10 0.69±0.04 0.87±0.112 0.80±0.141 100 0.52±0.041 0.67±0.062 0.78±0.082

表2 EPA、DHA对LPS刺激GMC MMP-9/TIMP-1 mRNA表达的影响(±s，n=3)Tab.2 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表2 EPA、DHA对LPS刺激GMC MMP-9/TIMP-1 mRNA表达的影响(±s，n=3)Tab.2 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

与LPS组比较:1P＜0.05，2P＜0.01Compared with LPS group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

组 别 浓度/(μmol/L)MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1 LPS组-0.74±0.06 1.78±0.05 0.42±0.05 EPA组 10 0.62±0.05 0.92±0.032 0.67±0.072 100 0.46±0.062 0.64±0.062 0.73±0.161 DHA组 10 0.56±0.09 0.74±0.042 0.77±0.131 100 0.50±0.071 0.61±0.062 0.82±0.042

表3 EPA、DHA对LPS刺激GMC产生TGF-β1蛋白含量的影响(±s，n=3)Tab.3 Effects of EPA and DHA on lipopolysaccharide stimulated TGF-β1 in GMC(±s，n=3)

表3 EPA、DHA对LPS刺激GMC产生TGF-β1蛋白含量的影响(±s，n=3)Tab.3 Effects of EPA and DHA on lipopolysaccharide stimulated TGF-β1 in GMC(±s，n=3)

与对照组比较:1P＜0.01;与LPS组比较:2P＜0.01Compared with control group:1P＜0.01;Compared with LPS group:2P＜0.01

组 别 浓度/(μmol/L) TGF-β1/(ng/mL)对照组-1.31±0.12 LPS组 - 1.93±0.101 EPA组 10 1.75±0.05 100 1.44±0.032 DHA组 10 1.78±0.09 100 1.38±0.102

LPS可致细胞MMP酶活性变化［15-16］，本研究结果显示，经 LPS刺激后，GMC表达 MMP-2、MMP-9 mRNA降低，但 TIMP-1、TIMP-2 mRNA增高，由于TIMP对MMP活性的抑制作用，造成MMP活性降低，在整体的表现即为ECM过度积聚，最终导致肾小球硬化。同时，在肾脏的损伤中，TGF-β1是个重要的细胞因子，其表达的增加可以进一步引起肾脏的损伤。本实验给予 EPA、DHA干预，通过对MMP、TIMP表达的影响，使MMP/TIMP比值提高，MMP活性增加，MMP/TIMP代谢失衡得以改善，同时TGF-β1的产生也显著降低，这可能是鱼油保护肾脏、延缓肾脏疾病进展的机制之一。

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