雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用

苏 瑞，强萌萌，王 楠，罗学刚，姜 勇，肖珊珊，成彩莲，张同存，，3

(1.天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;2.武汉科技大学 医学院，湖北 武汉 430065;3.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

主动脉血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)是一种多功能间叶细胞，它是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分［1］，在胚胎和成人的动脉壁损伤以及动脉粥样硬化等病变中均可见到平滑肌细胞分化与增殖的表型转变［2］。已有研究表明，平滑肌细胞处于分化型可抑制动脉粥样硬化发生，而处于增殖型则是导致动脉粥样硬化发展的关键因素。

雌激素是一种女性激素，人体内雌激素主要有雌二醇、雌酮及其代谢产物雌三醇，其中雌二醇生理作用最强，而雌三醇仅有部分作用。临床研究发现，雌激素对于VSMCs表型转化具有调控作用［3］，他莫昔芬、雷洛昔芬等抗雌激素药物则显示出具有减轻脂质致动脉粥样硬化的作用［4］。

SM22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)蛋白是Miller等［5-6］在1987年首次从鸡的胃平滑肌中分离而来的，因其相对分子质量为22 000而得名。SM22α是平滑肌最重要的的分化标记基因，其表达水平的高低是判定平滑肌处于分化型还是增殖型的重要标志。

为确定雌激素信号通路对VSMCs中SM22α转录表达水平的调节作用，本研究构建了SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒(SM22α-luc)，并利用荧光素酶报告分析方法，对17-β雌二醇(E2)、雌激素受体 α(Estrogen Receptor α，ERα)以及平滑肌重要转录调控因子Myocardin在SM22α转录调节过程中的作用进行了初步研究。

1 材料

Myocardin、ERα真核表达质粒、大肠杆菌DH5α、COS-7非洲绿猴胚肾细胞系均为天津科技大学分子药理实验室保存;实验所需大鼠基因组天津科技大学分子药理实验室提供。

Fastpfu酶购自北京全式金生物技术有限公司;转染试剂Fugene HD购自罗氏公司;E2购自Sigma公司，双荧光报告系统试剂盒购自Promega。

雌性SD大鼠，体质量60～70 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号:0036909。

2 方法

2.1 大鼠基因组DNA的提取

切取大鼠的肝脏组织块置于冰上，剔除结缔组织，剪碎放入研钵(越细越好)，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)吹悬，将洗涤后的肝脏细胞加裂解液500 μL和蛋白酶 K(终浓度100 mg/mL)，轻柔摇匀，然后将其置于50℃水浴中孵育3 h。将溶液冷却至室温，加入Tris-HCl(pH 8.0)平衡过的苯酚，温和混匀两相，室温离心，然后转移上层水相至离心管中，用氯仿抽提两次，将上层水相转移至另一离心管中，加NaCl(终浓度0.2 mol/L)和等体积的异丙醇，温和摇匀，离心弃上清，加入75%乙醇使沉淀悬浮，离心弃去乙醇。加入超纯水30 μL溶解基因组DNA，-20℃保存待用。

2.2 SM22α启动子的扩增

根据UCSC数据库检索获得的大鼠SM22α启动子序列，选择包含雌激素反应元件(Estrogen Response Elements，EREs，GGTCAnnnTGACC)和 Myocardin转录调控元件CArG box(CCW6GG，W为A或T)的-1100-+77序列，设计引物。其中 SM22αluc上游引物序列:5'-GCGAGCTCGTGAGTGTGTGAGACATAGCAC-3'，下游序列:5'-GCAAGCTTGGCTTGGTCGTTTGTGGACTG-3'。在引物中分别引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点(如下划线所示)。

以大鼠基因组为模版，利用FastPfu聚合酶进行PCR反应。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，扩增30个循环。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.3 SM22α-luc质粒的构建

PCR反应结束后，分别将PCR产物和pGL3-Basic质粒(图1)用SacⅠ和HindⅢ限制性内切酶于37℃酶切16 h，然后利用T4 DNA连接酶于16℃连接16 h。取连接产物10 μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有0.1%氨苄西林(Amp)的固体LB琼脂平板上，置于37℃培养箱培养过夜。随机挑选转化单菌落，接种于含0.1%Amp的液体LB培养基5 mL中，37℃振荡(200 r/mim)培养过夜。参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒的小量制备，1%琼脂糖凝胶电泳检测。菌液送上海Invitrogen公司进行测序验证。

图1 pGL3-basic载体图谱Fig.1 pGL3-Basic Vector circle map.

2.4 细胞培养

COS-7及VSMCs均采用含10%血清的DMEM完全培养基于37℃，95%O2和5%CO2培养箱进行培养。其中，VSMCs为取自于大鼠的原代细胞，具体操作如下:大鼠以颈椎脱臼法处死，迅速在无菌条件下开胸，暴露胸主动脉，小心剃除筋膜和附着的脂肪，取出约2 cm长胸主动脉，放入PBS洗净，在无菌工作台上小心剥去外膜和结缔组织，破坏内膜，用PBS冲洗干净后，把血管中膜剪成约1 mm3碎片，用尖嘴吸管将组织块放入培养瓶，均匀铺开使组织块规则排列，待组织块固定后加入含10%血清的DMEM，倒置培养瓶，在37℃，95%O2和5%CO2条件下培养。约1周后细胞长满瓶底，加入PBS冲洗后倒掉液体，用胰酶消化2～3 min后倒掉液体，再加入两倍量的含10%血清的DMEM，平分所得液体到原培养瓶和另一培养瓶中，继续培养。连续传代4～6次后用于实验。

2.5 转染

采用阳离子脂质体转染试剂Fugene HD对COS-7细胞系和VSMCs进行转染。转染前24 h，以1×105个/孔的细胞密度接种到24孔板中，转染步骤参照说明书进行，转染6 h后可换为正常培养液。

2.6 荧光素酶活性检测

细胞转染24 h后，吸去培养液，用冰预冷的PBS洗涤细胞。利用蛋白裂解液裂解细胞，按照Promega双荧光报告系统试剂盒说明书进行操作，利用荧光化学发光系统检测荧光素酶活性。

3 结果

3.1 SM22α-luc质粒的构建和测序

提取以大鼠基因组作为模板，利用设计好的引物进行PCR扩增，如图2所示，1%琼脂糖凝胶电泳后可检测到约1.1 kb的目的条带。

将PCR产物经过酶切后与pGL3-Basic载体连接后转化感受态细胞，挑取阳性克隆培养后提取质粒。把所提取的质粒进行双酶切验证，结果如图3所示，可检测到清晰的两条带，其中4 818 bp处为pGL3-Basic载体，1 063 bp处为SM22α启动子。进一步的测序分析结果显示，目标序列与源序列匹配率100%，表明质粒构建成功(图4)。

图2 琼脂糖凝胶电泳检测启动子的扩增Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of promoter amplification

图3 琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of double digestion

图4 测序比对结果Fig.4 Result of DNA sequence alignment

3.2 细胞的培养和传代

为考察E2对VSMCs中SM22α转录活性的影响，首先对大鼠VSMCs原代细胞进行了分离培养，结果如图5所示。由组织块周围游离出的VSMCs成典型的峰谷样、放射状生长，细胞形态多呈宽大的长梭形(图5A)。经过传代后，VSMCs生长速度加快，折光性加强，呈明显的长梭型(图5B)。

此外，还对冻存COS-7细胞进行了复苏培养，经过1～2次传代后，细胞生长速度明显加快，折光性好，胞体成不规则的长梭型(图6)。

图5 VSMCs的分离和培养(100×)Fig.5 Isolation and cultivation of VSMCs(100×)

图6 COS-7细胞的培养(100×)Fig.6 Cultured COS-7(100×)

3.3 E2/ERα信号通路对SM22α启动子转录活性的影响

为确定E2/ERα信号通路对SM22α启动子转录活性的作用，首先考察了 E2在 VSMCs中对SM22α-luc质粒荧光素酶活性的影响。用生理浓度的E2(10-8mol/L)处理VSMCs，结果表明，加入生理浓度E2组的SM22α-luc荧光素酶活性显著低于空白对照组(P＜0.05)，提示在有内源性ERα表达的VSMCs中，E2可以抑制SM22α在VSMCs中的转录活性。

在此基础上，为进一步揭示E2/ERα信号通路抑制SM22α启动子转录活性的潜在机制，进一步在COS-7细胞中对VSMCs分化关键转录因子Myocardin在这一过程中的作用进行了分析。结果如图7所示，Myocardin可明显增强SM22α-luc的活性，但当与ERα共同转染后，其活性则显著降低。同时，在E2存在情况下，ERα的这种抑制能力进一步显著增强。表明 E2/ERα信号通路可能通过拮抗Myocardin对SM22α启动子的转录激活功能，从而发挥抑制SM22α转录活性的作用。

图7 COS-7细胞中有或无E2时ERα、Myocardin对SM22-luc的影响Fig.7 ERα and Myocardin influence on the SM22-luc with E2 or not in COS-7

4 讨论

ERα是核受体超家族的成员，雌激素使其二聚化，并直接与雌激素反应基因上EREs结合或通过与其他的细胞核内转录调节蛋白相互作用，调控靶基因的转录，已有研究表明，雌激素及其受体(ERα)可以调节平滑肌细胞的增殖［7-8］。

Myocardin是一种特异性调节心肌和血管平滑肌细胞分化基因表达的转录因子，可以通过与血清反应因子(SRF)形成复合物结合到靶基因启动子上的CArG box(CCW6GG，W为A或T)位点来调节下游基因转录，在诱导心肌肥厚以及抑制血管平滑肌细胞增殖方面具有重要作用［9-10］，在心血管中的表达以及对血管保护方面具有良性作用［11］。

早期的回顾性研究表明，雌激素对绝经后女性的心血管有保护作用，因此催生了对绝经后女性的雌激素替代疗法。然而最近美国WHI(Women's Health Initiative)等多家机构的临床研究却均未能证明这一点，甚至提示弊大于利，这些多中心临床实验结果表明雌激素替代疗法会增加早期的心血管疾病的患病危险［12］。此外，他莫昔芬、雷洛昔芬等选择性ERα拮抗剂，则可以通过竞争性抑制ERα转录活性，并在动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗中体现出较好的临床效果。

通过生物信息学分析，我们发现平滑肌分化标志基因SM22α启动子上含有ERE和CArG box位点，提示其可能是ERα和Myocardin转录调控的靶基因。但有关ERα和Myocardin在SM22α转录调节中的相互关系，迄今尚未见报道。

本文通过构建 SM22α-luc质粒，在 VSMCs和COS-7细胞中，利用Luciferase Report Assay实验证明了E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SMC标志基因 SM22α-luc的转录活性，从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变。本研究的进一步深入开展，将有望为选择性雌激素受体调节剂等药物的合理临床应用提供新的理论指导。

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