骨肽注射液对新生大鼠的成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

钱建国，吴秋丽

(1.河北辛集市第二人民医院 河北 辛集 052360;2.天津医科大学，天津 300192)

骨肽注射液在临床常用于骨折和修复坏死骨治疗骨质疏松等，并取得良好效果［1］，但骨肽注射液对上述病症的治疗机理研究较少，本课题研究了骨肽注射液对新生大鼠的成骨细胞生长的影响，考察其疗效的可能机制。

1 材料

骨肽注射液(国药准字 H20003923，批号:100101规格:2 mL∶10 mg)，蚌埠市宏业生化制药厂;D-Hanks液，天津百浩生物科技有限公司;DMEM培养基，上海源聚生物科技有限公司;胰蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司;Ⅱ型胶原酶，美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)，上海川翔生物科技有限公司;碱性磷酸酶，上海科兴生化试剂有限公司;NBT-BCIP碱性磷酸酶检测试剂盒，昊柏生物科技有限公司。

DNM-9602酶联免疫检测仪，上海京工实业有限公司;BB5060细胞培养箱，德国Hereus公司。

健康新生SD大鼠，雄性，1 d龄，河北省实验动物中心中心提供，合格证号:SCXK(冀)2008-1-003。

2 方法

2.1 小鼠成骨细胞的体外培养及鉴定

取新生1 d健康SD大鼠5只，处死，于75%酒精浸泡10 min，置于消毒培养皿中，剪开头顶皮肤分离颅盖骨，将颅盖骨放入D-Hanks液中去除骨膜及周围结缔组织，D-Hanks液冲洗2次，剪成0.1 mm3的骨片块，浸入0.25%胰蛋白酶，37℃消化30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加Ⅱ型胶原酶10 mL，37 ℃振荡消化 2 h，1 000 r/min离心5 min，DMEM培养液冲洗3次，重复离心。加含10%FBS的DMEM培养液制成细胞悬液，调节细胞密度为1×105，接种于培养瓶，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h后换液，每2 d换液1次，原代细胞至铺满瓶底，0.25%胰酶消化，多次贴壁法纯化成骨细胞。培养至第3代待用。倒置显微镜下连续观察细胞形态，NBT-BCIP法定性检测碱性磷酸酶，鉴定成骨细胞［2-3］。

2.2 对成骨细胞增殖的影响

无血清培养24 h后吸去培养基，每孔1×105个细胞的密度接种于5个96孔培养板中，每孔分别加含骨肽浓度为0，75，150，300，600 和1 200 μg/mL的无血清DMEM培养液至200 μL，每组5个重复孔，同时以正常培养的细胞作对照，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。分别于第1～6天用MTT法测定成骨细胞的增殖能力。

2.3 对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响［4］

2.3.1 牛血清白蛋白标准曲线 取标准牛血清白蛋白，稀释成1 g/L，采用梯度稀释方法，得到25，50，75，100，125，150，175 和 200 mg/L 稀释液，取1 μL稀释100倍，加入显色剂考马斯亮蓝1 mL，在595 nm波长处测定吸光度值，作标准曲线。

2.3.2 酶联免疫法检测骨肽注射液对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性 取第3代大鼠成骨细胞，按2×104个/孔细胞密度接种于6孔细胞培养板中培养12 h，细胞贴壁后，换无血清培养基培养24 h使细胞同步化，在各孔内分别加入含25，50，100，200 μg/L骨肽注射液的培养液，继续培养。在培养的第3，6，9和12天，用PBS液冲洗3次，胰酶消化，每孔加入3 mL培养基终止消化，混匀离心，弃上清加入磷酸缓冲液5 mL，混匀离心，弃上清控干，加入磷酸缓冲液80 μL混匀后存于-20℃冰箱待检。以正常培养的细胞作对照，每组5个复孔。检测之前反复冻融细胞3次，超声裂解，在酶联免疫检测仪测定405 nm波长处的吸光度值，换算样本中每1 mg蛋白的碱性磷酸酶活性(nkat/L)。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 成骨细胞鉴定

NBT-BCIP法定性检测碱性磷酸酶，产生蓝紫色化合物。

3.2 各组大鼠成骨细胞吸光度比较

与对照组比，骨肽注射液150～1 200μg/L组第6天的细胞增长速度较快(P＜0.05)，并呈现剂量依赖性，骨肽注射液300～1 200 μg/L组对成骨细胞的增殖的促进作用明显，但600和1 200 μg/L的增长速度与300 μg/L相当，提示骨肽注射液300 μg/L对成骨细胞的增长促进作用最明显。见表1。

3.3 各组大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性比较

与对照组比，骨肽注射液各个组别对培养3，6，9和12 d的骨细胞碱性磷酸酶活性较高(P＜0.05)，骨肽注射液300～1 200 μg/L组的碱性磷酸酶活性增长速度明显，但600和1 200 μg/L的增长速度与300 μg/L相当，提示骨肽注射液300 μg/L的成骨细胞碱性磷酸酶活性表达最显著。见表2。

表1 骨肽注射液对大鼠成骨细胞增殖的影响(±s，n=5)Tab.1 Results of Bone Peptide Injection on neonatal rat osteoblast proliferation(±s，n=5)

表1 骨肽注射液对大鼠成骨细胞增殖的影响(±s，n=5)Tab.1 Results of Bone Peptide Injection on neonatal rat osteoblast proliferation(±s，n=5)

与对照组比较:1P＜0.051P＜0.05 vs control group

组 别 剂量/(μg/L)吸光度值1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d对照组 - 0.571±0.102 0.709±0.069 0.865±0.044 0.921±0.052 1.124±0.075 1.175±0.104骨肽组 75 0.603±0.024 0.721±0.084 0.908±0.055 0.934±0.072 1.152±0.092 1.202±0.091 150 0.674±0.047 0.823±0.096 0.945±0.06111.027±0.07811.184±0.081 1.197±0.095 300 0.762±0.09010.854±0.10510.961±0.07411.181±0.12211.252±0.09711.344±0.1111 600 0.772±0.09910.862±0.11010.972±0.09411.154±0.11611.263±0.10011.301±0.1301 1200 0.755±0.08310.840±0.08710.967±0.07211.134±0.05511.254±0.04411.307±0.212

表2 各组大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性比较(±s，n=5)Tab.2 The results of Bone Peptide Injection on alkaline phosphatase activity(±s，n=5)

表2 各组大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性比较(±s，n=5)Tab.2 The results of Bone Peptide Injection on alkaline phosphatase activity(±s，n=5)

与对照组比较:1P＜0.051P＜0.05 vs control group

组 别 剂量/(μg/L)碱性磷酸酶活性/(nkat/L)3 d 6 d 9 d 12 d对照组 - 0.541±0.042 0.761±0.070 0.941±0.051 1.212±0.073骨肽组 75 0.624±0.0521 0.820±0.104 0.992±0.074 1.301±0.090 150 0.651±0.0421 0.874±0.0541 1.020±0.053 1.344±0.082 300 0.707±0.0621 0.922±0.0701 1.084±0.0821 1.391±0.0401 600 0.715±0.0411 0.935±0.0521 1.073±0.0411 1.380±0.0641 1200 0.711±0.0671 0.911±0.0501 1.081±0.0641 1.392±0.0541

4 讨论

成骨细胞是骨形成和骨重建中重要的功能细胞，成骨细胞的增殖、分化受多种因子的调节［5］。骨肽注射液含有机钙、磷、无机钙、无机盐、微量元素、氨基酸等多种骨代谢的活性肽类代谢因子，通过各种骨生长因子直接作用于成骨细胞，可诱导骨髓细胞转化为成骨细胞，促进骨髓成骨作用，同时调节骨代谢，直接调节骨钙磷代谢，增加骨钙磷沉积，刺激成骨细胞增殖促进骨质合成［6-7］。Robinson等［8］体外研究显示骨肽可促成骨形成，增加骨密度，对人和家兔的骨髓间质细胞具有较强的调节作用。Chen等［9］研究骨肽可增加成骨细胞特异性中心结合因子-1(cbfa-1)的mRNA表达;目前最新研究显示骨肽通过激活RhoA/ROCK途径调节骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化［10］。本课题研究骨肽注射液对大鼠成骨细胞具有明显的增殖作用，提示骨肽注射液诱导大鼠成骨细胞增殖，增加成骨细胞的数量，促进骨组织生长。

碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞功能和分化程度的特异性指标，其活性的高低可作为评估成骨细胞成熟的指标。没有碱性磷酸酶，成骨钙化不能发生。本课题结果显示与对照组比，随着骨肽注射液浓度的增加，碱性磷酸酶的活性增加明显，与成骨细胞增殖分化过程与骨形成标志物碱性磷酸酶分泌水平一致的原理吻合，并呈现剂量依赖性关系。可见本品不仅促进骨的碱性磷酸酶活跃表达，也可促进成骨细胞进一步分化，与文献结果一致［10］。

［1］ 李兰珍.注射用骨肽联合红花注射液治疗骨关节病疗效分析［J］.医学信息，2010，4(1):64.

［2］ 王长军，殷国勇，李 翔.骨髓间充质干细胞与成骨细胞复合培养对成骨细胞增殖的影响［J］.江苏医药，2011，37(11):1244-1247.

［3］ 刘正伟，高学军，吕丹娜.低分子牛骨多肽制备及对大鼠成骨细胞的影响［J］.中国生化药物杂志.2007，32(1):4-8.

［4］ 廖新梅，王 捷，王 江，等.骨唾液酸蛋白稳定性及成骨活性研究［J］.中国生化药物杂志，2009，34(4):247-250.

［5］ Kaur G，Valarmathi M T，Potts J D.Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates［J］.Biomaterials，2010，31(7):1732-1741.

［6］ 阮莲芝.骨肽注射液的临床应用［J］.中国临床药学杂志，2008，17(5):320-323.

［7］ 施 莱.骨肽注射液在骨科的应用进展［J］.社区医学杂志，2010，8(7):38-39.

［8］ Robinson D，Bab I，Nevo Z.Osteogenic growth peptide regulates proliferation and osteogenic maturation of human and rabbit bone marrow stromal cells［J］.J Bone Miner Res，1995，10(5):690-696.

［9］ Chen Z X，Chang M，Peng Y L，et al.Osteogenic growth peptide C-terminal pentapeptide［OGP(10-14)］acts on rat bone marrow mesenchymal stem cells to promote differentiation to osteoblasts and to inhibit differentiation to adipocytes［J］.Regul Pept，2007，142(1-2):16-23.

［10］徐 杨，陈统一，林飞跃，等.合成成骨生长肽对人骨髓间充质干细胞成骨转化的促进［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(6):1053-1058.