博落回内生真菌的分离及其抗菌活性的初步研究

闵长莉，王 允，汪学军

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽 六安 237012）

博落回内生真菌的分离及其抗菌活性的初步研究

闵长莉1，2，王 允1，汪学军2

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技术实训中心，安徽 六安 237012）

从健康博落回植株中分离内生真菌，用PDA培养基分离纯化菌株，结果纯化得到19株内生真菌，用琼脂块法对获取的菌株进行抗菌活性筛选，其中有2株博落回内生真菌对指示菌株有抑菌作用，占总分离菌株的10.53%，其中有一株内生真菌具有较强的抑菌活性。

博落回；内生真菌；分离；抗菌活性

博落回（Macleayacordata（Willd）R.Br.）又名号筒杆，系罂粟科植物，全株均可入药。博落回在我国长江中下游地区广泛分布，民间作为杀虫农药和治疗疥癣等在我国有着悠久的历史。近年来国内外研究结果表明：博落回全草中富含多种生物碱［1］［2］（P133）［3］，这些生物碱多属于异喹啉衍生物，具有驱虫、抗菌、消肿、止咳、平喘、镇痛、抗肿瘤等功效。临床已用于痔疮、脓性指头炎、滴虫性阴道炎、宫颈糜烂等的治疗，效果显著［4］。作为植物源农药，博落回有效活性成分的获得主要从植株中获取，因此会受到季节的限制，且要大量砍伐博落回，会造成资源不合理利用和物种枯竭。所以，探寻获取博落回有效活性成分的新途径成为现今需要解决的问题。

从近年来的研究看，植物体中存在内生真菌是普遍的。植物内生真菌能产生新的天然产物，甚至可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物，因而成为天然产物的重要来源［5］。1993年Stierle等［6］首次从太平洋短叶红豆杉（Taxomycesandrenae）中分离到可产生抗癌药物紫杉醇的内生真菌，云南大学郭波、李海燕、张玲琪等人分别从长春花（Catharanthusroseus）、桃儿七（Sinopodophyllumhexandrum）中分离出产长春花碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌［7］［8］，而本课题组也从喜树（CamptothecaacuminataDecne）中分离出产10－羟基喜树碱的内生真菌［9］［10］。目前，博落回内生真菌的研究还鲜见有报导。因此，开展博落回内生真菌的分离及其代谢产物的研究，无疑将为人类从微生物角度寻找博落回有效活性成分开辟一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 植物材料 博落回植株于2011年8月采自安徽省金寨县天堂寨风景区，经妥善处理后带回实验室供试。

1.1.2 实验菌株 革兰阴性细菌：大肠杆菌（Escherichiacoli），铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）；革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）；均购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.3 主要器械 恒温恒湿培养箱（PYX－150HA），科立仪器；电热蒸汽压力消毒器（YX－450），上海三申医疗器械有限公司；洁净工作台（SW－CJ－1C（U）），苏州安泰空气技术有限公司；照相机（佳能650）。

1.2 培养基配制

1.2.1 内生真菌分离培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基［11］。

1.2.2 指示菌培养基 牛肉膏蛋白胨培养基［11］。

1.3 内生真菌的分离

分别将博落回根、茎、叶在自来水下冲净后进行表面消毒，先用75%的酒精浸洗2分钟，无菌水冲洗4次，0.1%升汞消毒2分钟，无菌水冲洗4次，再用无菌刀片将材料切成小块后，将上述组织块置于PDA培养基上于恒温箱进行28℃恒温培养，与此同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测博落回植株表面消毒是否彻底。培养3-4天后，及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落接种到新鲜PDA平板上。纯化3-5次直到得到形态完全一致的单菌落即纯化的内生真菌。

1.4 抗菌实验

1.4.1 指示菌的活化与菌悬液制备 大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌分别接种于直径为90mm牛肉膏蛋白胨平板上于37℃活化18h。用接种铲分别刮取上述四种指示菌菌株至加有玻璃珠30m L无菌生理盐水中，放置于摇床震荡30min，使菌体分散均匀，制备成菌悬液后放置于4℃冰箱中备用。

供试菌株的处理：将分离纯化得到的内生真菌分别接种于PDA平板上28℃培养7-14d，用直径6mm的无菌打孔器打孔，制成菌饼。

1.4.2 抑菌实验 采用琼脂块法。分别取1.4.1活化指示菌悬液0.2m L于牛肉膏蛋白胨平板上，用玻璃涂布器涂布均匀后，再把所分离得到的内生真菌菌饼置于指示菌平板中央，培养1-2d；测量并记录各菌饼抑菌圈的大小。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的分离结果

从博落回根、茎、叶材料中共分离到内生真菌19株（结果见表1），从实验结果可以看出在茎、叶部位分离纯化得到的内生数目较多，而根部最少。

表1 博落回内生真菌分离结果

2.2 内生真菌的抗菌活性

对上述19株内生真菌分别进行抑菌活性筛选，结果筛选得到2株内生真菌对供试菌株有抗菌活性，占分离菌株总数的10.53%；其中，由根部分离得到的内生真菌BLH005和由茎部分离得到的内生真菌BLH009对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌圈大小分别为4.21cm、1.15cm；对另外三种指示菌无抑制作用，且内生真菌BLH005具有较强的抑菌活性。

2.3 有抑菌活性内生真菌的形态特征

2.3.1 菌株BLH005 该菌株在PDA平板上生长缓慢，呈放射状生长，5d后菌落的直径约为3cm；菌落在5d内颜色纯白色，并且在菌落表面有水滴样渗出物，背面灰白色；7d后菌落表面开始变为灰白色，边缘不太整齐，菌丝致密；9d后在PDA培养基上背面出现暗红色色素、正面颜色变化不大（如图1A所示）。

2.3.2 菌株BLH009 该菌生长缓慢，在生长初期，菌落直径较小，菌落表面浅绿色，质地紧密，边缘较整齐。随着培养时间的延长，菌落直径逐步变大，至培养5d时，可达1.6cm，且颜色变深为墨绿色，菌落边缘呈现一个白边，中央隆起，高度达0.5mm左右（如图1B所示）。

图1 菌株BLH005和菌株BLH009在PDA上的形态结构图A：菌株BLH005；B：菌株BLH009

3 讨论

自从Guerin等（1898）从黑麦草中分离出第一株内生真菌以来，关于内生真菌的研究已有100多年的历史。研究发现它在植物组织中普遍存在，并具有丰富的物种多样性［12］［13］。到目前为止，人们对博落回内生真菌的研究方面鲜见有文献报导。因此，开展博落回内生真菌的研究，可以更加全面反映自然界中内生真菌的多样性，发掘出内生真菌新资源，为进一步筛选博落回内生真菌活性物质奠定基础。

从近年来的研究看，植物内生真菌具有普遍的抑菌活性［14－16］。本研究从博落回中分离得到的19株内生真菌，其中对金黄色葡萄球菌具有拮抗活性的菌株占到总菌株数的10.53%，也再次印证了这个观点；并且发现内生真菌BLH005的代谢产物具有较高的抑菌活性。

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［8］李海燕，曾松荣，张玲琪.云南桃儿七植株地下茎内生真菌多样性及有价值菌株的筛选［J］.西南农业学报，1999，12（4）：123－125.

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A Preliminary Study on Isolation of Endophytic Fungi fromMacleaya
Cordataand Its Antimicrobial Activity

MIN Chang-li1，2，WANG Yun1，WANG Xue-jun2
（1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China2.AnhuiPlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China）

Nineteen endophytic fungal strains were isolated from the healthyMacleayacordataby flat-panel separation.Agar block method was used to obtain the strain for antimicrobial activity screening.The results showed that two endophytic fungi（10.53%of the total strains isolated）had inhibitory activities to the test strains，and a strong inhibitory activity of endophytic fungus was also be found.

Macleaya cordata；endophytic fungi；isolation；antimicrobial activit y

Q932.331

A

1009－9735（2012）02－0004－03

2012－03－13

国家自然科学基金项目（31100019）。

闵长莉（1975－），女，安徽霍邱人，皖西学院生物与制药工程学院讲师，硕士，研究方向：微生物药物学。