珍龙醒脑胶囊对小鼠脑缺氧及脑缺血再灌注损伤的保护作用

高 伟 张会鲜 孙建云 焦 波 (山东大学药学院药理教研室，山东 济南 250012)

脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不仅不能恢复，却出现更加严重的脑功能障碍，造成脑缺血再灌注损伤(CIR)〔1〕。珍龙醒脑胶囊是治疗脑血管疾病的经典藏药验方，主要由珍珠、天竺黄、西红花、丁香、人工牛黄、麝香、余甘子等中药组成，临床上用于治疗缺血性脑血管疾病〔2〕，但其机制尚未有报道。本研究观察珍龙醒脑胶囊对脑缺氧、脑缺血再灌注后丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影响，探讨该药抗CIR的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 珍龙醒脑胶囊，青海金诃藏药药业股份有限公司，批号20090413。脑心通胶囊，陕西步长制药有限公司，批号110336。均以1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬液。SOD、MDA及ATP酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器 紫外分光光度计，TU-1810，北京普析通用公司。

1.1.3 动物 昆明种小鼠，18～22 g，雄性Wistar大鼠，250～300 g，雄性;均由山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(鲁)20090001。

1.2 方法

1.2.1 珍龙醒脑胶囊对小鼠常压缺氧的影响 将小鼠随机分为空白组(1%CMC-Na)、脑心通组(900 mg/kg)、珍龙醒脑组(100、200、400 mg/kg)。每天给药1次，给药前禁食12 h不禁水，连续7 d。于末次给药后2 h，将小鼠置于含5 g有钠石灰的密封250 ml广口瓶中，以呼吸停止为指标，观察小鼠死亡时间。1.2.2 珍龙醒脑胶囊对小鼠断头缺血缺氧的影响 小鼠分组及给药同1.2.1，于末次给药后2 h，将小鼠断头，以张口为指标，观察断头后喘息时间。

1.2.3 珍龙醒脑胶囊对结扎颈总动脉致小鼠脑缺血缺氧的影响 将小鼠随机分为假手术组(1%CMC-Na)、模型组(1%CMC-Na)，脑心通组(900 mg/kg)、珍龙醒脑组(100、200、400 mg/kg)。每天给药1次，给药前禁食12 h不禁水，连续7 d。末次给药后2 h，将小鼠麻醉后，分离双侧颈总动脉，夹闭10 min，再灌注10 min，反复2次。再灌注后缝合皮肤(假手术组分离出颈总动脉，不夹闭血管，然后缝合)。24 h断头取脑，在低温下分取左、右脑。取左脑称重后置80℃烘烤2 h，称干重，计算脑组织含水量。脑组织含水量(%)=(左脑湿重－左脑干重)/左脑湿重×100%。将右脑组织充分匀浆，采用考马斯亮蓝蛋白定量法测定蛋白含量，按照试剂盒要求测定SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力和MDA含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。

2结果

2.1 珍龙醒脑胶囊对小鼠常压缺氧的影响 动物置密封广口瓶中后，呼吸逐渐减弱，直至消失。用药后各组与空白对照组〔(42.1±8.5)min〕比较，动物存活时间有所延长，珍龙醒脑低、中剂量组小鼠存活时间为〔(45.3±9.1)、(49.9±10.6)min〕，其中脑心通〔(56.7±10.5)min〕、珍龙醒脑高剂量组〔(53.0±11.0)min〕，能明显延长小鼠存活时间(P＜0.05)。

2.2 珍龙醒脑胶囊对小鼠断头缺血缺氧的影响 动物被断头后，张口呼吸动作仍会持续。用药后，可以明显延长断头后呼吸维持时间。珍龙醒脑高剂量〔(22.1±3.3)s〕和中剂量组〔(22.3±3.3)s〕以及脑心通组〔(23.2 ±3.6)s〕与空白组〔(19.1±2.7)s〕相比，均能明显延长小鼠断头喘息时间(P＜0.05);珍龙醒脑低剂量组断头喘息时间〔(20.3±3.5)s〕虽略延长，但无显著差异(P＞0.05)。

2.3 珍龙醒脑胶囊对结扎颈总动脉致小鼠脑缺血缺氧的影响

缺血24 h后，与假手术组比较，模型组小鼠脑含水量明显增加，珍龙醒脑有明显的降低脑含水量的作用(P＜0.05或P＜0.01)。同时，模型组小鼠脑组织中MDA含量明显升高，SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力显著降低(P＜0.01)，珍龙醒脑可明显降低 MDA含量，并升高 SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力。见表1，表2。

表1 珍龙醒脑胶囊对缺血再灌注小鼠脑组织含水量、MDA和SOD的影响(x ± s，n=9)

表2 珍龙醒脑胶囊对缺血再灌注小鼠脑组织酶活力的影响(x ±s，n=9，μmol·mg－1·h－1)

3讨论

脑缺血时，组织氧和能量代谢的物质供应不足，ATP生成减少，能量功能障碍，Na+，K+-ATP酶活性降低，使大量 Na+内流、K+外流，使Cl－和水被动进入细胞内，引起神经细胞急性渗透性肿胀死亡。Na+和K+浓度改变，导致细胞膜去极化，进而电压依赖性 Ca2+通道开放，Ca2+大量内流。Ca2+可抑制ATP合成，使能量生成障碍〔1〕，同时细胞内钙超载，细胞内游离Ca2+异常增多，使细胞膜结构受损〔3〕，进一步加重脑损伤。同时由于K+、蛋白激酶C及递质释放等作用，受体依赖性 Ca2+通道开放，Ca2+大量内流，造成细胞内钙超载，进而导致氧自由基产生增加、花生四烯酸代谢增强、兴奋性氨基酸递质(EAA)释放增加等，导致神经元坏死。ATP酶活性下降还可激活Na+泵依赖性EEA载体，使EAA大量释放，开放Ca2+通道，加重脑损伤〔4，5〕。本实验结果发现，珍龙醒脑胶囊可明显提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活力，有效降低脑含水量。提示珍龙醒脑胶囊可以对抗脑缺氧的能量代谢障碍，并能够降低脑水肿的脑含水量。

脑缺血可以造成氧自由基增加〔6〕。氧化应激损伤是脑缺血再灌注的重要环节之一，氧自由基在CIR中有重要作用。氧自由基可作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，蛋白质变性、多核苷酸链断裂、碱基重新修饰，造成细胞结构的完整性破坏、膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致 EAA释放增加，促使CIR发生〔1〕。SOD可清除自由基，提高SOD活性可以提高抗氧化作用及组织缺氧能力〔7，8〕。双侧颈总动脉结扎后导致增加脂质过氧化反应，MDA生成增加，SOD活性下降〔9〕。本实验发现珍龙醒脑组可明显降低MAD的量，并且有效提高SOD的活力，提示可对抗CIR的氧自由基损伤。

珍龙醒脑胶囊为传统藏药，主要由珍珠、天竺黄、西红花、丁香、人工牛黄、麝香、余甘子等中药组成，具有活血化瘀、安神护脑、祛风化痰、养阴活血、化痰通络等功效，用于痰瘀阻络所致的中风，语言蹇涩，半身不遂，口眼歪斜。现代药理研究表明，珍珠富含多种氨基酸，还含有微量元素、小分子活性肽、卟啉及金属卟啉等，可以减轻自由基损伤;西红花的化学成分主要是胡萝卜素及其多糖苷类，可以增强记忆、降血压、抗血栓;诃子含三萜类、酚酸类、脂肪族化合物，具有强心、抗氧化和抗动脉粥样硬化等作用;麝香含多种氨基酸和微量元素，麝香酮具有兴奋动物呼吸的作用，可以使动物呼吸频率和深度增加;人工牛黄含牛磺酸、牛胆粉、去氧胆酸、胆红素、微量元素，拮抗血小板聚集与血栓形成。该药可以溶解血栓，消除动脉粥样硬化斑块，解除血管平滑肌痉挛，扩张血管，改善微循环，增加血流速度，降低血液黏度，扩张微小动静脉，降低脑血管通透性。最终减少自由基损伤、提高脑灌注、保护脑细胞、提高脑功能、改善脑梗死的预后〔2〕。

综上所述，本实验初步证明珍龙醒脑胶囊通过降低MDA含量，升高SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力，有效降低脑含水量，对小鼠脑缺氧及CIR具有保护作用，其抗CIR作用与保护脑组织ATP酶活性、抑制脂质过氧化反应和减轻自由基损伤有关。

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5 王晓良.应用分子药理学〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社，2005：215.

6 Chan PH.Role of oxidants in ischemic brain damage〔J〕.Stroke，1996;27(6)：1124-9.

7 朱 怡，陈 霞，黄 屏，等.丹参川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.现代中西医结合杂志，2011;20(7)：802-4.

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9 Nade VS，Kawale LA，Dwivedi S，et al.Neuroprotective effect of Hibiscus rosa sinensis in an oxidative stress model of cerebral post-ischemic reperfusion injury in rats〔J〕.Pharm Biol，2010;48(7)：822-7.