维吾尔族、汉族乳腺癌患者BRCA1基因的表达及差异

傅亚婷 艾秀清 成 芳 (新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830016)

目前乳腺癌发生、发展的分子机制尚不完全清楚，研究发现乳腺癌发病的病理生理过程是基因累积效应和环境因素共同作用的结果〔1〕。在相同的环境条件下个体的基因背景决定了乳腺癌的易感性〔2〕。目前已发现多种与乳腺癌发病相关的易感基因，其中作为 DNA修复基因的乳腺癌易感基因1(BRCA1)是近年来研究的热点。相关研究发现BRCA1在癌组织中的表达具有种族差异性〔3〕。故本研究选取新疆地区维吾尔族和汉族乳腺癌患者，观察BRCA1在癌组织和癌旁组织中的表达及其民族差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 从新疆医科大学附属肿瘤医院组织标本库选取2010年11月至2011年6月收治的经过临床病理确诊、术前均未经放疗和化疗、临床资料完整的女性乳腺癌患者140例，其中维吾尔族、汉族各70例乳腺癌组织及癌旁正常组织标本，用于mRNA检测。随机选取维吾尔族27例、汉族27例用于检测蛋白表达;年龄 26～72岁，平均年龄：维吾尔族(45.81±18.64)岁，汉族(49.37±21.93)岁。乳腺癌组织分级按2003年WHO标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，浸润性导管癌118例、髓样癌8例、小叶癌10例、大叶腺癌4例。有淋巴结转移89例、无淋巴结转移51例。雌激素受体(ER)阳性88例、ER阴性52例。孕激素受体(PR)阳性97例、PR阴性43例。

1.1.2 一般情况 入组样本必须满足维、汉之间在年龄分层、病理分级、肿块大小、免疫组化情况、淋巴结转移中的分布无显著差异，保证入组样本在维、汉之间的均衡可比性，见表1。

1.1.3 主要试剂与仪器 RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司);RevertAid逆转录试剂盒(加拿大Fermentas公司)，PCR即用试剂盒、SYBR实时荧光定量试剂盒、引物合成(大连宝生物工程有限公司)，一抗兔抗-BRCA1/BAP1(北京Bioss公司)，抗β-肌动蛋白(β-actin)鼠单克隆抗体、羊抗兔二抗、蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、非预染Marker、丽春红染色试剂(北京康为试剂生物科技有限公司)。icycler型PCR扩增仪、DC2000凝胶成像分析仪、iQ5荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

表1 入组标本一般情况均衡性比较(n=70，n)

1.2 方法

1.2.1 采用SYBR荧光实时定量PCR检测BRCA1 mRNA在组织中的表达 操作步骤：用Trizol试剂提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度。采用逆转录试剂盒(Fermentas)将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，具体按操作手册执行。扩增后，用2%琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物。实时定量PCR按照SYBRR PremixExTaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)操作手册执行。见表2。用β-actin进行内参校正，检测出的结果是目的基因BRCA1与参照基因β-actin的比值。

表2 各基因的引物序列、PCR产物片段大小和RT-PCR扩增条件

1.2.2 采用Western印迹技术检测BRCA1在组织中的蛋白表达 蛋白提取液按1∶99加蛋白酶抑制剂混匀，按1∶10(g/ml)加样品中匀浆后提取总蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)试剂盒进行蛋白定量。配制8%的分离胶，5%的浓缩胶进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用半干法按照电流1.2 mA/cm2膜面积，恒流转膜。转膜后丽春红染色试剂染色，观察转膜效果。5%脱脂奶粉〔Tris盐酸缓冲液(TBST)溶解的，pH7.5〕室温封闭1 h。封闭液稀释一抗，室温孵育30 min，4℃过夜。TBST洗膜后用Western印迹 封闭液Ⅱ稀释二抗，室温40 min。TBST洗膜后用ECL发光试剂盒进行检测。使用DNR荧光凝胶成像系统Micro Chemi曝光成像。显影结果使用ImageJ软件进行分析处理，结果用相对光密度值(ROD)×面积(mm2)表示。BRCA1蛋白的相对含量用(目的条带的ROD×mm2)/(β-actin条带的ROD×mm2)表示。

1.3 统计学方法 用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据均进行正态性检验，计量资料以x±s表示，癌与癌旁的比较采用配对t检验，两民族间比较采用成组t检验。

2结果

2.1 实时荧光定量检测乳腺癌组织及癌旁组织中BRCA1 mRNA的表达 维吾尔族、汉族乳腺癌组织中BRCA1 mRNA表达均低于相应癌旁组织(P＜0.05)，见图1、表3。维吾尔族乳腺癌组织较癌旁组织BRCA1 mRNA表达降低的幅度(－0.756±0.239)高于汉族(－0.255±0.075)(P＜0.05)。

图1BRCA1 mRNA基因扩增电泳图

2.2 Western印迹法检测乳腺癌组织及癌旁组织中BRCA1蛋白表达 维吾尔族、汉族乳腺癌组织中BRCA1蛋白表达均低于相应癌旁组织(P＜0.05)。见图2，表4。维吾尔族乳腺癌组织较癌旁组织BRCA1蛋白表达降低的幅度(－4.282±0.278)明显高于汉族(－1.901±0.278)(P＜0.05)。

表3 BRCA1 mRNA在乳腺癌患者癌组织及癌旁组织的表达(x±s)

表4 BRCA1蛋白在乳腺癌患者癌组织及癌旁组织的表达(x±s)

图2 BRCA1蛋白在乳腺癌组织和癌旁组织的表达

3讨论

BRCA1是与乳腺癌发生相关的DNA修复基因，在损伤修复、转录调控、细胞周期调控中发挥重要作用〔4〕。乳腺组织中BRCA1表达缺失可促进乳腺癌的发生。研究表明，BRCA1 mRNA在乳腺癌组织中表达下降，并且与预后相关〔5〕。Marcus等〔6〕研究发现，美国女性散发性乳腺癌中，癌细胞与正常上皮细胞相比较，癌细胞中BRCA1表达减少，且BRCA1的减少与潜在高恶性有显著联系。BRCA1基因在转录水平和翻译水平的表达有一致性，肿瘤发生时出现mRNA转录水平的下调，导致转录水平的蛋白表达下降。故认为癌组织中BRCA1的表达降低与乳腺癌的发生密切相关。

李鸿涛等〔7〕检测维吾尔族女性乳腺癌组织中BRCA1失表达率为37.9%，根据研究显示维吾尔组BRCA1表达阳性率明显高于汉族女性组，提示维、汉女性散发性乳腺癌组织BRCA1的阳性表达可能存在种族差异;维吾尔族散发性乳腺癌组BRCA1表达低于维吾尔族乳腺纤维瘤组，提示BRCA1蛋白的失表达或低表达和新疆维吾尔族散发性乳腺癌的发生有关。本研究发现维吾尔族乳腺癌组织与癌旁组织BRCA1基因表达降低的幅度明显高于汉族，维、汉之间差异有统计学意义。认为种族遗传背景可能成为影响BRCA1基因表达的因素，维吾尔族可能更容易发生乳腺癌易感基因表达的降低或缺失，本文推测BRCA1基因可能在维吾尔族的遗传背景下有其独特的肿瘤学行为，BRCA1基因表达缺失或表达降低有可能与维吾尔族乳腺癌的发生关系更为密切。

作为重要的DNA修复基因，BRCA1等基因在转录水平和翻译水平表达的改变在不同程度上影响了乳腺癌的发生，并表现出种族差异。后续的研究中课题组将加大样本量，对BRCA1基因与维、汉乳腺癌的关系做进一步的分析。

1 Florea AM，Büsselberg D.Metals and breast cancer：risk factors or healing agents〔J〕?J Toxicol，2011;20(11)：159619.

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3 Perry CS，Oterc JC，Palmer JL，et al.Risk factors for breast cancer in East Asian women relative to women in the West〔J〕.Asia Pacific J Clin Oncol，2009;5(4)：219-31.

4 Turner NC，Reis Filho JS，Russell AM，et al.BRCA1 dysfunction in sporadic basal like breast cancer〔J〕.Oncogene，2007;26(14)：2126-32.

5 Margeli M，Cirauqui B，Castella E，et al.The prognostic value of BRCA1 mRNA expression levels following neoadjuvant chemotherapy in breast cancer〔J〕.PLoS One，2010;5(3)：9499.

6 Marcus JN，Watson P，Page DL，et al.Hereditary breast cancer：pathobiology，prognosis，and BRCA1 and BRCA2 gene linkage〔J〕.Cancer，1996;77(4)：697-709.

7 李鸿涛，阿力比亚提·艾马，马斌林，等.新疆维吾尔族女性散发性乳腺癌组织中BRCA1、C-erBb-2的表达分析及其临床意义〔J〕.中国癌症杂志，2010;20(9)：658-62.