人血管内皮细胞生长因子受体1酪氨酸激酶的克隆与表达

陈晓青，杨 荣，张 磊，邱文洪，李 艳，黄 丹

(江汉大学医学院1.医学实验中心，2.基础部，湖北 武汉 430056)

人血管内皮细胞生长因子受体1酪氨酸激酶的克隆与表达

陈晓青1，杨 荣2，张 磊2，邱文洪2，李 艳1，黄 丹1

(江汉大学医学院1.医学实验中心，2.基础部，湖北 武汉 430056)

目的 克隆人血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1酪氨酸激酶(VEGFR1/Flt-1)基因，构建其表达载体，为其应用研究奠定基础。方法 应用RT-PCR技术，对可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sVEGFR1/sFlt-1)胞外区前四个结构域基因片段进行扩增，亚克隆至pUCl8质粒，进行测序后，建立其表达载体，获得重组质粒pSGL-gpp-F，并将其转化至Streptomyces lividans TK24，获得基因工程菌株pSGLgpp-F，对其培养上清液进行SDS-PAGF及Western blot分析。结果 在信号肽gpp的引导下，sFlt-1在S.lividans中获得成功分泌表达，且表达的sFlt-1具有和配基VEGF结合的生物学活性，但在信号肽vis的控制下，未获成功表达。结论 sFlt-1经分离提纯后，可用于与抑制血管生成相关的疾病的研究，而利用重组sFlt-1建立VEGF拮抗剂筛选模型，对于从组合化学库等天然来源的化合物中，提取高通量、大规模药物的筛选提供了可能。

血管内皮生长因子受体;基因表达;酪氨酸激酶;克隆

血管内皮生长因子(VEGF)是一个具有相似结构的生长因子家族，其成员均属于酪氨酸蛋白激酶，亦均属于同源二聚体糖蛋白，如VEGF-A、B、C、D和胎盘生长因子(PIGF)［1］，以及如受体 R1(Flt1)、R2(KDR)、R3(Flt4)等，其家族成员均具有促进细胞增殖，加速血管生成，增加血管通透性等功效，而血管生成参与了组织再生、伤口愈合、子宫内膜周期性增生以及肿瘤的转移和血管生成等多种病理和生理过程。因此，VEGF在心血管、烧伤等学科具有广阔的应用前景［2］。

VEGF主要通过促进血管内皮细胞的增殖、分化，进而增加微血管对大分子物质的通透性，其介导的多途径信号转导通路中特异的膜受体而发挥生物学效应。VEGF受体1酪氨酸激酶(VEGFR1/Flt-1)作为其酪氨酸激酶受体，介导了血管形成过程中内皮细胞的游走、组织因子的产生、滋养层细胞NO的释放、以及VEGF刺激的单核细胞和巨噬细胞的游走。Flt-1胞内域的酪氨酸激酶直接参与了VEGF与Flt-1结合后的胞内信号转导途径［3］。VEGFR1/Flt-1在血管生成中可通过调节内皮细胞之间以及内皮细胞与细胞间质之间的作用，发挥促进细胞的迁移和血管成形的重要作用，本研究以此为切入点，就VEGFR1/Flt-1的克隆、表达和功能进行探索，试图为相关疾病的医药开发提供基础。

1 材料

1.1 菌株和质粒

菌株 E.coli TG1:S.lividans TK24，从人脐静脉内皮细胞克隆获得编码Flt-1胞外区的前四个结构域(sFlt-1)，观察其在变铅青链霉菌S.lividans TK24的分泌表达。

质粒PUC18(用于测序)，本室保存;pSGLgpp(链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒，含PUC18及S.globisporus分泌信号肽gpp的最小复制区)，本室自行构建;pUW1216(链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒)，本室保存;pBSC(含S.venezuelae分泌信号肽vis及其调控全序列)，本室保存。

1.2 工具酶和试剂

总RNA提取试剂盒，BioDev Tech公司;RTPCR试剂盒、DNA回收试剂盒，QLAGEN公司;限制性内切酶，Promega公司;Tap DNA聚合酶及T4DNA连接酶，Sangon公司;小鼠抗人Flt-1单克隆抗体、小鼠抗人VEGF单克隆抗体，R＆D Sytem公司;酪氨酸蛋白激酶试剂盒，上海工硕生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig G抗体，北京中山生物技术有限公司。

2 方法

利用RT-PCR技术获得sVEGFR1/sFlt-1胞外区前四个结构域基因片段，经酶切后亚连接至测序质粒PUC18，测序正确后构建其表达载体pSGLgpp-F，将表达载体转化至链霉菌S.lividans TK24进行原核表达，并用SDS-PAGE和Western blot验证。

PCR产物的纯化、限制性内切酶反应、DNA的连接、质粒的转化、重组克隆筛选和质粒抽提等技术均参照《分子克隆实验指南手册》［4］进行。

2.1 总RNA提取

根据试剂盒说明书进行操作。

2.2 扩增目的基因片段

按照已知基因序列设计引物。上游引物P1:5'-GCGGAATTCTCCTGAACTGAGTTTAAAAGGC-3'，引入Eco RⅠ限制酶切位点;下游引物 P2:5'-CAAAGCTTTCACTGGGGTTTCACATTGAC-3'，引 入终止密码子TGA及HindⅢ限制酶切位点。以提取的总RNA为模板，45℃逆转录30 min后，进行预变性，共35个循环，依次为94℃ 5 min，94℃ 2 min，66℃ 1 min，72℃ 1 min。而后再次进行72℃延伸10 min。可得到扩增编码Flt-1的核苷酸片段。回收Flt-1基因片段，以此为模板进行扩增，行琼脂糖制备凝胶电泳。

2.3 pUC-F质粒的构建及测序

双酶切Flt-1基因片段、pUC18分别经Eco RⅠ和HindⅢ，使用T4DNA连接酶进行连接，将得到的重组质粒行DNA测序。

2.4 构建重组质粒

双酶切pUC-F用Eco RⅠ、HindⅢ，以及质粒pSGLgpp，分别回收Flt-1片段、5.6 kb片段，并与已经回收的Flt-1片段连接，转化S.lividans TK24，提取重组子质粒，进行酶切鉴定;将Flt-1片段连接于pBSC质粒，构建重组质粒 pBSC-F，经 Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后，获得vsi-HindⅢ片段，连接经双酶切后的质粒pUWL219，再转化E.coli TG1，获得重组质粒 pUWL219-vis-F，将其转化于 S.lividans TK24中。

2.5 SDS-PAGE

在YEME培养基5 mL中接种重组转化子，置于28℃培养24 h后，转接种于CM培养基50 mL中，28℃培养72 h，取上清进行SDS-PAGE分析。

2.6 蛋白印迹受体配基结合实验

将样品在未煮沸的过程中加入不含二硫苏糖醇的上样缓冲液，进行SDS-PAGE和Western blot转移，完成后取下硝酸纤维素膜，加用含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液，4℃封闭过夜。而后使用纤维素膜经TBS漂洗，用0.1 mL/cm2含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液、VEGF165溶液(1 mg/mL)10μL封袋，室温缓慢震荡3 h，TBS漂洗纤维素膜3次，5 min/次。

3 结果

3.1 重组质粒的构建以及鉴定

在获得的Flt-1基因片段之中插入pUC18质粒，得到重组质粒，测序结果显示，在850和1 168 bp处扩增的Flt-1基因均发生了相应的氨基酸A→G 突变，即er→Gly、Thr→Ala，但由于突变位置为受体非结合区，因此不影响sFlt-1的生物学活性。

3.1.1 重组质粒pSGLgpp-F的构建鉴定 质粒pSGLgpp-F经Eco RⅠ和HindⅢ双酶切后，得到1.2 kb的片段，与Flt-1基因片段大小一致(图1)。提示Flt-1基因插入了pSGLgpp-F质粒，以pSGLgpp-F为模板进行PCR，可得到1.2 kb片段，从而进一步证明Flt-1基因插入了pSGLgpp质粒。

图1 重组质粒pSGLgpp-F的Eco RⅠ/HindⅢ酶切鉴定

3.1.2 重组质粒pUWL219-vsi-F的构建鉴定 将Flt-1基因片段连接至pBSC质粒，获得pBSC-F(图2)。pBSC-F经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后，获得1.8 kb的片段vis-F，为vis序列(0.6 kb)和目的基因片段(1.2 kb)之和，提示目的基因片段插入了pBSC-F(图3)。pBSC-F经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切，得到相应1.8 kb的片段vis-F，表明vis-F片段插入了PUWL219质粒。

3.2重组蛋白的表达

3.2.1 SDS-PAGE 培养上清SDS-PAGE分析结果表明，与对照 S.lividans(pSGLgpp)相比，S.lividans(pSGLgpp-F)表达产物在63.6 kD处有明显条带，与文献报道一致［4］。而 S.lividans(pUWL219-vis-F)表达产物与对照S.lividans(pUWL219)相比，没有明显差别，表明Flt-1在S.lividans(pSGLgpp-F)中获得了分泌表达，而在S.lividans(pUWL219-vis-F)中未检测到表达。

3.2.2 Western blot 对 S.lividans(pSGLgpp-F)的培养上清进行Western blot分析，结果显示在63.6 kD处出现特异性杂交条带，因此确认表达产物为Flt-1，表明Flt-1基因在 S.lividans(pSGLgpp-F)中获得了分泌表达。

3.2.3 蛋白印迹受体配基结合实验 63.6 kD处出现特异性杂交条带，提示表达产物sFlt-1具有与配基VEGF165相结合的生物学活性。

图2 重组质粒pBSC-F的Bam HⅠ/HindⅢ酶切鉴定

图3 重组质粒 pUWL219-vis-F的Bam HⅠ/HindⅢ酶切鉴定

4 讨论

链霉菌作为新发展起来的原核表达系统，以其既具有的多种信号肽，能介导外源蛋白分泌表达，且又不会形成包涵体，从而使得蛋白处理工艺简单化，使得外源蛋白大量降解等特点而成为实现宿主多种不同来源异源基因的表达研究中的热点［5-6］，外源蛋白分泌表达能力的强弱与蛋白的类型、启动子的强弱、信号肽的选择密切有关。本研究中采用两种不同的分泌信号肽gpp和vis，其中gpp属于S.globisporus产生的新型抗生素C1027辅基蛋白分泌信号肽，以期探索Flt-1基因在链霉菌S.lividans分泌表达的影响，研究中将其编码序列引入链霉菌质粒pSGLN，通过以自行构建的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pSGpp为载体，成功表达了 VEGFR1/Flt-1。经SDS-PAGE、Western blot分析以及受体-配基结合实验结果显示，在gpp引导下，Flt-1在S.lividans中获得成功表达，在vis的控制下，未获成功表达。成功表达的Flt-1具有和配基VEGF结合的生物学活性。提示不同的信号肽对同一基因的表达作用各异。

同时，序列测定发现，在850和1 168 bp处扩增的Flt-1基因均发生了相应地氨基酸A→G突变。已有研究证实，影响VEGF与Flt-1结合的重要因素为谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺，蛋白印迹配基结合实验证实了发生的两个氨基酸突变对表达的sFlt-1的生物学活性并没有影响。但sFlt-1在链霉菌中获得了成功表达的产物与VEGF可特异性结合则表明其具有配基结合生物活性。

可见，sFlt-1可作为受体拮抗剂，可与天然的VEGFR形成竞争性结合VEGF，可使得VEGF生物学活性降低，导致血管生成受抑，其表达的sFlt-1经分离提纯后，可用于抑制与血管生成的相关疾病研究中;同时，利用重组sFlt-1建立VEGF拮抗剂筛选模型，对于从组合化学库等天然来源的化合物中，提取高通量、大规模药物的筛选提供了可能。

本研究首次在原核表达系统成功的基础上，得到大量可溶的具有酶活性的Flt-1酪氨酸激酶融合蛋白，为高通量筛选寻找受体的抑制剂提供了模型。我们已采用此模型筛选得到了若干个有效抑制剂，为寻找抑制肿瘤血管生成的先导化合物提供技术支持。

［1］张乃哲.血管内皮生长因子及其受体与临床研究进展［C］//2006年全国微循环与血液流变学暨分子生物学新进展学术研讨会专题学术报告论文集，2006.

［2］常 影，姜 新.简述血管内皮细胞生长因子(VEGF)的研究进展［J］.中国民族民间医药，2010，18(6):65-67.

［3］庄书斐，叶其壮.血管内皮生长因子受体1酪氨酸激酶的克隆、表达和功能［J］.生物化学与生物物理学报:英文版，2002:34-38.

［4］萨姆布鲁克，J萨姆布鲁克，鲁塞尔，等.分子克隆实验指南(精编版)［M］.黄培堂，译.北京:化学工业出版社，2008.

［5］沈会芳，刘叔文，林壁润.链霉菌2504的研究初报［J］.广东农业科学，2009(9):12-15.

［6］孙晓琳.冰城链霉菌C5-O-methyltransferase基因克隆、表达及体外功能分析［D］.哈尔滨:东北农业大学，2010.

Cloning，expression and characterization of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Tyrosine Kinase

CHEN Xiao-qing1，YANG Rong2，ZHANG Lei2，QIU Wen-hong2，LI Yan1，HUANG Dan1
(1.Medical Experimental Center，2.Deparment of Basic Science，Medical School of Jianghan University，Wuhan 430056，China)

Q78

A

1005-1678(2012)05-0631-03

2012-06-20

陈晓青，女，本科，实验师。