黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究*

董 基 刘 钊

（肇庆学院化学化工学院，肇庆 526061）

黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究*

董 基**刘 钊

（肇庆学院化学化工学院，肇庆 526061）

以桔粉为原料，以黑曲霉（Aspergillus niger）为发酵菌株，采用液体发酵法生产纤维素酶。通过单因素试验考查了麸皮和蛋白胨的比例（C/N）、装液量及接种量3个因素对产酶的影响，并在此基础上，通过正交试验确定了发酵产酶的工艺条件为：添加桔粉80 g/L，麸皮和蛋白胨质量比为1∶2、250 mL三角瓶装30 mL Mandels氏营养液、接种量3 mL，于30℃下培养72 h，纤维素酶产量达到1885.71 U/g。

桔粉；黑曲霉；液体发酵；纤维素酶

纤维素酶是具有降解含有β-1，4糖苷键的纤维素的一组酶的总称，广泛应用于酿造果汁与蔬菜加工、粮食加工、饲料、造纸、中草药有效成分的提取、纺织、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面。我国是柑桔生产大国，每年都会产生很大一部分落果和滞销果，这部分废弃柑桔一般都是直接扔弃，既浪费了资源，又污染了环境。

柑桔富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种维生素和矿物元素，是一种良好的微生物生长基质。黑曲霉是公认安全（GRAS） 的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性。利用黑曲霉液体发酵柑桔产纤维素酶目前未见报道。本文通过黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究，旨在为纤维素酶的液体发酵生产提数据参考，也为废弃柑桔的综合利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

桔子落果，本地桔园获得，无腐烂，将其烘干磨成粉末，备用。

黑曲霉（Aspergillus niger）：本院微生物试验室保藏。

1.2 仪器设备

UV-1801紫外/可见分光光度计，北京北分瑞利分析仪器公司；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；HH-S2数显恒温水浴锅，金坛市鑫诺试验仪器厂；DHG-9070B数显电热恒温干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；DGX-9143B-1电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛试验设备有限公司；YX280AS手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限责任公司；BS-1E恒温振荡培养箱，金坛市恒丰仪器厂。

1.3 培养基

1.3.1 营养液

Mandels氏营养液。

1.3.2 斜面培养基

PDA培养基：马铃薯（去皮） 200 g，葡萄糖5 g，KH2PO41 g，水1000 mL，自然pH，琼脂5 g。

1.3.3 发酵产酶培养基

产纤维素酶基础培养基：柑桔粉80 g/L，其他组分按照单因素试验方案进行配置，pH 6.5。

摇瓶发酵培养基：将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制备成孢子悬液，按培养基体积10%(约1.2×108个孢子)接种到产纤维素酶基础培养基中，于30℃、200 r/min振荡培养72 h。

1.4 主要试剂

3，5-二硝基水杨酸（DNS） 试剂：取酒石酸钾钠182 g，溶于500 mL蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3 g，氢氧化钠10 g，苯酚5 g，无水亚硫酸钠5 g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置72 h后使用。

柠檬酸缓冲液（pH 4.8，0.05 mol/L）：取40 mL 0.1mol/L柠檬酸与60 mL 0.1 mol/L柠檬酸三钠混合，再加200 mL蒸馏水稀释一倍。

1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 溶液：称取1 g羧甲基纤维素钠，精确至1 mg，缓缓加入pH为4.8的柠檬酸缓冲液80 mL，水浴加热至全部溶解。搅拌均匀，冷却后定容至1000 mL，再用二层纱布过滤。此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3 d。

1 g/100mg葡萄糖标准贮备溶液：称取预先于（103±2） ℃下干燥至恒重的葡萄糖1.000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 mL，即为1 g/100 mL浓度的葡萄糖标准溶液。

1.5 方法

1.5.1 纤维素酶活力测定

采用DNS法。

1.5.2 葡萄糖标准曲线的制作

分别配制 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL标准葡萄糖使用溶液，各吸取0.50 mL于试管中，同时分别吸取柠檬酸缓冲液1.5 mL、DNS试剂3.0 mL于上述试管中，混匀。将试管置于沸水浴中，反应7 min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10 mL，混匀。用10 mm比色杯，以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计λ=540 nm处测吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。相关系数R2应在0.999 0以上时方可使用(否则须重做)。

1.5.3 酶活力计算

纤维素酶活力按下式计算：

式中：X——纤维素酶活力，U/g；

A——根据吸光度在标准曲线上查得（或从回归方程计算出） 的还原糖生成量，μg/mL；

V——样品提取时加入水的量，mL；

N——样品二次稀释时的稀释倍数；

0.5——参与反应的酶量，g；

W——样品量，g；

10——反应时间，min。

1.5.4 试验设计

1.5.5.1 单因素试验

分别考察麸皮和蛋白胨的质量比（C/N）（A）、装液量（B） 及接种量（C） 三个重要因素对产酶的影响。

1.5.4.2 正交试验

在单因素试验基础上，进行3因素3水平正交试验，采用L9（34）正交表，对试验结果进行极差分析，通过极差分析确定方案。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

按1.5.2中的方法绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程：D（λ） =0.000 2ρ+0.040 2，R2=0.999 6。标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，相关系数R2为0.999 6，大于0.999 0，说明回归方程拟合良好，因此可以使用该葡萄糖标准曲线。

2.2 麸皮和蛋白胨的质量比（C/N）对产酶的影响

将麸皮（辅助碳源） 与蛋白胨（氮源） 按不同质量比混合成同质量浓度（6 g/mL固形物）的培养基。取30 mL Mandels氏营养液于250 mL三角瓶中，做7次试验，加入麸皮与蛋白胨不同质量比的混合物，分别为0∶6、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、6∶0，然后置于30℃下振荡培养72 h，收获后测定酶活力。麸皮与蛋白胨的质量比对纤维素酶产量的影响见表1。

表1 麸皮与蛋白胨不同质量比对产酶的影响

表1表明，麸皮（辅助碳源） 与蛋白胨（氮源） 按1∶2的质量比混合使用，更有利于酶产量的提高。氮源是黑曲霉生长必需的，麸皮作为辅助碳源，可供菌体早期迅速生长并促进产酶，故选用高氮低辅助碳的培养基较为适合。

2.3 装液量对产酶的影响

在250 mL的三角瓶中分别加入20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL的Mandels氏营养液(发酵液)，按80 g/L加入桔粉、按6 g/100 mL加入麸皮及蛋白胨组成培养基，并接入等量的孢子，置于30℃下振荡培养72 h，收获后测定酶活力。不同装液量对黑曲霉产纤维素酶的影响见图2。

图2 装液量对产酶的影响

图2表明，装液量30 mL黑曲霉产纤维素酶的产量最高。由30 mL至60 mL来看，随着装液量的增加，酶活力减少，说明黑曲霉的生长和产酶的多少都与通气量有很大关系；装液量为20 mL时酶活力比装液量为60 mL时的要高，这是因为发酵培养过程中一直处于恒温状态，会导致部分失水，所以对发酵过程造成一定的影响。因此最佳装液量选择30 mL。

2.4 接种量对产酶的影响

分别在装好桔粉和麸皮蛋白胨混合物的250 mL三角瓶中加入30 mL Mandels氏营养液，再分别接入1.5 mL、3 mL、4.5 mL、6 mL、7.5 mL种子液，然后置于30℃下振荡培养，进行发酵培养72 h，收获后测定酶比活力。接种量对产酶的影响如图3所示。

图3 接种量对产酶的影响

由图3可知，当接种量为Mandels氏营养液体积的10%时，黑曲霉的产酶量最高；接种量大于15%时，酶活力开始下降。这说明在一定的环境条件下，底物量一定时，微生物种群达到一定数量将会对其本身产生抑制作用，对其生长和产酶都有一定程度的不利影响，故选择10%接种量为佳（即接种量为3 mL）。

2.5 发酵培养基优化正交试验

在单因素影响发酵产酶的研究基础上，以发酵培养基的麸皮和蛋白胨质量比、装液量及接种量3因素作为影响黑曲霉发酵生产纤维素酶的主要的因子，设计3因素3水平的正交试验，采用L9（34）表，因素水平设计见表2，试验结果见表3。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

极差分析表明，各因素对产酶影响的主次顺序为：A＞C＞B，最优水平为A1C1B1，即麸皮和蛋白胨质量比为1∶2，接种量为3 mL，装液量为30 mL。此方案在正交试验范围内，此条件下所得酶活力为1 885.71 U/g。

3 结论

以黑曲霉为试验材料，采用液体发酵法，考察发酵桔粉产纤维素酶的培养条件。结果表明：添加柑桔粉80 g/L、麸皮和蛋白胨质量比为1∶2（6 g/100 g固形物）、250 mL三角瓶装30 mL Mandels氏营养液、接种量3 mL，于30℃下培养72 h，纤维素酶产量达到最高。研究表明，黑曲霉可作为纤维素酶生产的优良菌种。

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Study on production of celluase by Aspergillus niger with orange powder by liquid fermentation

DONG Ji**LIU Zhao
（College of chemistry and chemical engineering of Zhaoqing university，Zhaoqing 526061，China）

With orange powder as raw materials and Aspergillus niger as production strains，cellulase was producted by liquid fermentation.Three important factors of ratio of bran and peptone （C/N），liquid volume in flask，and inoculums size on cellulose activities were researched respectively by single factor test.Based on it，the enzyme production conditionswereoptimized by orthogonal test.The optimum conditions of enzyme production were adding 80 g/L orange powder，1∶2 ratio of bran and peptone，adding 30 mL Mandels nutrient solution to 250 mL flask，3 mL inoculums size，culturing 72 h at the temperature of 30 ℃.Activities of cellulase producted on the above conditions were 1885.71 U/g.

orange powder；Aspergillus niger；liquid fermentation；cellulase

TS201.3

A

1673-6004（2012）01-0034-04

肇庆学院自然科学青年项目（No.201106）

** 董基，女，1973年出生，1994年毕业于肇庆学院食品科学与工程专业，实验师

2011-09-25