芪灯明目胶囊对VEGF转基因斑马鱼血管生成的影响

陶铮 滕晋

近年来国内外对斑马鱼的研究逐渐深入,由于斑马鱼早期发育的过程中胚胎透明,可直接观察到各组织器官,并且血管系统生成方式简单,在显微镜下就能够直观的观察到节间血管形态,因而以之作为理想的研究血管形成药物筛选模式动物[1]。血管荧光标记的转基因斑马鱼可以于荧光显微镜下清晰地进行斑马鱼节间血管的计数,考察药物的抑制血管生成的作用,能够快捷的计算抑制率。本试验观察芪灯明目胶囊对斑马鱼血管生成的影响,并且通过实验得出斑马鱼的最大耐受浓度,对药品毒理实验提供参考指标。

1 材料与方法

1.1实验材料

(1)VEGF转基因斑马鱼由山东省科学院药物筛选平台提供,芪灯明目胶囊由成都中医药大学眼科实验室提供。

(2)实验仪器仪器:Airtech 洁净工作台,日本 OLMPUS SZX-16荧光显微镜,日本 OLMPUS X1倒置显微镜,培养皿,24孔板,灭菌手术器械(手术刀,剪刀,镊子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2实验方法

(1)斑马鱼准备:实验所用的斑马鱼为血管荧光转基因斑马鱼(VEGFR2:GFP)。斑马鱼的养殖和培育参照Westerfield[2]的方法。选择成熟斑马鱼雌雄一对,傍晚时放入培育缸中,产卵后取出受精卵,单独放入28℃光照培养箱备用。

(2)施药:鱼胚胎于24hpf后取出,置于1 μg·ml-1链霉蛋白酶溶液中数分钟后,用吸管吹去胚胎卵膜,将脱膜胚胎加入24孔板中,每孔20只;将试验药物加入24孔板中,分别设置对照组,对照组10个,不加入任何药物;芪灯胶囊组分别配制终浓度为165 μg·ml-1、248 μg·ml-1、330 μg·ml-1、495 μg·ml-1、660 μg·ml-1、825 μg·ml-1等6个组,24小时后观察结果。

(3)结果观察:将试验用24孔板取出,每孔取出 30 μl溶液,加入 1‰三卡因溶液麻醉鱼体,随后用吸管吸出鱼体放于载玻片上,在荧光显微镜下观察记录斑马鱼异常和血管荧光强弱状况,并对体节间血管计数,同时记录死亡数。

1.3血管抑制率的计算

多个样本均数采用单因素方差分析,组间比较采用t检验。

2 实验结果

2.1斑马鱼节间血管抑制率实验

实验结果显示芪灯明目胶囊具有抑制血管生成的作用,在248 μg·ml-1至660 μg·ml-1抑制率表现出统计学差异,即使在浓度165 μg·ml-1时仍然具有部分抑制节间血管形成的作用,表现出芪灯明目胶囊能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成。

表1 芪灯明目胶囊对斑马鱼胚胎体节间血管生成的抑制作用

注：与对照组相比较,*P<0.05,**P<010

图

2.2斑马鱼最大耐受浓度实验

结果显示,用药组胚胎165 μg·ml-1～495 μg·ml-1均能良好生长,660 μg·ml-1浓度以上各组胚胎出现了心率缓慢和翘尾的体态变化,浓度达到825 μg·ml-1大部分胚胎死亡,仅有少部分存活。

通过该实验我们可以看到,芪灯明目胶囊对于斑马鱼最大耐受浓度达到660 μg·ml-1,通过其与大鼠剂量转换关系,再结合《人和动物的体表面积计算法、不同种类动物之间药物剂量换算法》[2]推论出芪灯明目胶囊人最大耐受剂量为105.6 mg/kg。

3 讨论

斑马鱼是近年来新兴的抗血管生成药物筛选模型,具有易于观察、实验周期短、样品用量少等优点,与分子、细胞水平筛选模型相比较有自身的优势。国外学者研究认为斑马鱼胚胎特别是血管荧光转基因斑马鱼胚胎是一种较理想的抗血管生成活性评价活体动物模型[3]。本试验应用此模型研究了芪灯明目胶囊的抑制血管生成作用,结果显示其能够抑制斑马鱼胚胎体节间血管生成。本实验中所用转基因斑马鱼是将荧光蛋白标记在血管 VEGFR2上,血管在紫外光激发下显现出荧光血管的形态,可在显微镜下直接观察计数,观察血管的形成非常简易方便。

芪灯明目胶囊是针对糖尿病视网膜病变非增殖期的阴虚燥热,肝肾亏虚和目络癖滞的基本病机,以益气养阴,活血通络之法,结合临床及中药的现代研究的成果,优选三味中药并对其进行了现代工艺的提取,确定以黄酮类物质为主的有效部位群制而成。DR的发生发展与VEGF、FGF、EGF等多种新生血管生长因子有关,VEGF是一种直接反映视网膜新生血管进程的重要的分子信号,在视网膜病变的早期发展中起重要的作用[4]。此次研究,过观察药物对转基因荧光标记VEGFR2的斑马鱼血管生成的影响,证明了芪灯明目胶囊对VEGF2的抑制作用,能够对糖尿病视网膜病变的发生发展起到一定的预防和治疗作用,也为接下来的机制研究提供证据支持。

[1] Westerfield M,Wegner J,Jegalian BG,Specific activation of mammalian Hox promoters in mosaic transgenic zebrafish[J].Genes Dev,1992 Apr;6(4):591-8.

[2] 章元沛.药理学实验[M].2.人民卫生出版社:238.

[3] Cross LM,Cook M A,Lin S,et al.Rapid analys is of angio-genesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay [J].Arterio-scler Thromb Vasc Biol,2003,23(5):911-912.

[4] 李强,段俊国,王红义.芪灯明目胶囊对自发性糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶C表达的影响[J].眼科新进展,2010,3(3):210-213.