葛根素对血管生成抑制作用的研究

陶铮 段俊国 高娜 李强

通过前期芪灯明目胶囊对VEGF转基因斑马鱼血管生成的影响研究,发现胶囊有效成分之一葛根素具有抑制血管生成的作用,我们利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖模型和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型进一步试验,证实了葛根素具有抗血管生成活性。

1 材料与方法

1.1实验材料

脐内皮细胞(HUVEC)由齐鲁制药公司药物研究院提供,第7代;鸡胚由济南滋平种蛋有限公司提供。

试剂:M199培养基及DMEM购自Gibco公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA);二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自上海生物工程有限公司,胎牛血清购自Gibco公司;Matrigel 购自BD公司;其它试剂为国产分析纯,生理盐水。

实验仪器仪器:Airtech 洁净工作台,德国Binder CO2培养箱,美国DYNEX Spectra MR 1SPA-0093型酶标仪,日本 OLMPUS X1倒置显微镜,培养皿,96孔板,灭菌手术器械(手术刀,剪刀,镊子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2实验方法

(1)观察多个浓度下葛根素对脐内皮细胞增殖的抑制作用。

实验步骤:HUVEC用无血清的M199培养液稀释到1×105个/mL,按96孔板每孔100μl接种于96孔培养板中,每孔加2%成纤维细胞生长因子(bGFG),96孔板放入CO2培养箱24 h。细胞贴壁后去除培养基,实验组分别加入终浓度为20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1的含葛根素的M199培养基,溶剂对照组加入含0.1%DMSO的M199培养基;另设空白对照组,只加入M199培养基。每组均设4个复孔,培养24 h后,各孔加入20 μL/孔MTT溶液(5 g/L)继续培养4 h。弃上清液,加入150 μL DMSO溶解,振荡混匀。在自动酶标仪上570 nm处检测吸光度(A)值记录OD值,统计各组细胞数量并计算各组抑制率。

抑制率的计算方法如下:

(2)观察多个浓度下葛根素对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

实验步骤:取7日龄50只鸡胚蛋,随机分组为5组,每组10个,在照卵灯下寻找胚头中轴侧区域,划定1 cm×1 cm圆形开窗部位,用75%乙醇溶液消毒开窗部位,在鸡胚气室端钻孔2 mm小孔并穿透壳膜。暴露出鸡胚尿囊膜,将明胶海绵放置于尿囊膜上血管部位,用微量进样器将葛根素配液滴加入甲基纤维素滤膜中,分别为60 μg/个、100 μg/个,160 μg/个加药完毕后用胶带密实封口。并继续放入38℃的孵箱内孵育72 h。

新生血管数量计算:揭开透明胶带,加满4%多聚甲醛,4℃下原位固定30 min。待CAM上血管内的血液凝固后,揭去封窗的透明膜,剪除CAM水平以上的蛋壳,以滤膜载体为中心把CAM剪下,投入水中,使其舒展开,并将其在水中转移到载玻片上,自然干燥。拍照后用Photoshop选定照片上的一定面积(300×300像素),计算3个面积内的平均血管数目计入统计,并运用Image pro-plus统计血管面积计入统计。

2 实验结果

2.1内皮细胞的增殖的抑制作用

实验结果显示对照组细胞生长良好,溶剂组对细胞生长无影响;用药组葛根素从10～80 μg·mL-1均显示出明显的抑制内皮细胞生长的作用,在20 μg·mL-1就显示出较佳的抑制率,达到25%抑制率,40 μg·mL-1以上未见剂量依赖性增长。

2.2葛根素对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用

实验结果显示,对照组微孔滤膜周围血管CAM血管生成良好,成树枝状呈非特异性的贯穿、杂乱、包绕、叶脉样、平行生长,手术组微孔滤膜周围CAM血管数目明显多于对照组,用药组出现用药区域无血管区或血管断裂现象,且血管变细、侧枝减少、药物滤膜远端血管密度增加等现象,尤其细小血管数目显著减少。与对照组比较葛根组160 μg·mL-1具有显著性抑制血管面积的作用,与手术组比较葛根组中高剂量具有显著性抑制血管面积的作用。

A:对照组.B:葛根素20 μg·mL-1.C:葛根素40 μg·mL-1.D:葛根素80 μg·mL-1.

注:与对照组比较△P<0.01;与手术组比较**P<0.01

3 讨论

葛根素(puerarin)是由豆科植物野葛(puerarialobata)甘葛藤(puerarinthomsonii)根中提取的一种黄酮昔。具β肾上腺素受体阻滞作用,可增强心肌收缩力,保护心肌细胞;扩张血管,降低血压及眼内压,改善微循环的功效。国内研究发现糖尿病伴血管病变患者静滴葛根素3个疗程后,血浆ET水平降低,N0水平升高,而对照组无此现象[1]。表明葛根素有通过改善血流动力学,纠正神经内分泌系统的失衡及对内皮细胞的保护作用,从而达到防治糖尿病血管并发症的目的,但具体抑制新生血管的机制有待研究。

A:对照组.B:手术组。C:葛根素60 μg.D:葛根素100 μg.E:葛根素160 μg

葛根素是芪灯明目胶囊有效成分之一,芪灯明目胶囊是针对糖尿病视网膜病变非增殖期的阴虚燥热,肝肾亏虚和目络癖滞的基本病机,以益气养阴,活血通络之法,结合临床及中药的现代研究的成果,优选三味中药并对其进行了现代工艺的提取,确定以黄酮类物质为主的有效部位群制而成。DR的发生发展与VEGF、FGF、EGF等多种新生血管生长因子有关,VEGF是一种直接反映视网膜新生血管进程的重要的分子信号,在视网膜病变的早期发展中起重要的作用[2]。此次研究发现葛根素在10～80 μg·mL-1范围内均具有抑制脐内皮细胞增殖的作用,在60～160μg/个范围内均具有较强的抑制鸡胚尿囊膜微血管生成的作用。可以知道芪灯明目胶囊能够对糖尿病视网膜病变的发生发展起到一定的预防和治疗作用,为接下来重点针对新生血管生长因子信号传导通路的机制研究提供证据引导。

[1] 杜红艳.葛根素治疗缺血性视神经病变的疗效观察[J].临床眼科杂志,2003,11(1):77.

[2] 李强,段俊国,王红义.芪灯明目胶囊对自发性糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶C表达的影响[J].眼科新进展,2010,3(3):210-213.