微波辅助脱钙技术在猪脱钙骨基质制备中的应用研究

任智超 王 欣 刘宝林

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

REN Zhi-Chao WANG Xin* LIU Bao-Lin

（School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China）

引言

我国生猪产业发达，据统计我国每年消耗生猪4 000万吨以上，其中，大量猪的后腿骨干骺端没有被充分利用，仅在煲汤后被当作垃圾丢弃。已有研究表明，猪后腿骨干骺端主要由松质骨组成，而松质骨是制备脱钙骨基质的优良材料，因此利用猪后腿骨干骺端制备脱钙骨基质可以加大对其的利用，变废为宝，有着广阔的发展前景。

脱钙骨是一种自体可降解的抗原灭活的异种或同种异体骨质，是骨组织工程常用的一种生物衍生材料。1965年，Urist证实脱钙骨具有诱导成骨作用［1］。随后，脱钙骨的成骨诱导活性被大量的试验研究和临床实践所证实［2－5］。脱钙骨具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性。目前脱钙骨的制备方法主要采用传统的Urist法，该方法操作简单，制备成本低，但需耗费大量的时间（一般为12 h以上）。微波辐射可加剧分子运动，提高分子平均能量、降低反应活化能，从而提高化学反应速度，甚至改变化学反应机理，启动新的反应渠道［6］。近年来有学者采用微波技术对人牙齿脱钙效果进行研究，结果显示微波技术能缩短人牙齿脱钙的时间，并且牙齿表面脱钙均匀［7］。亦有学者研究了微波技术在骨组织病理技术中的应用，结果表明，微波技术不但可以加快骨组织的脱钙速度，同时有利于骨组织在免疫染色和免疫抗原修复中的应用［8］。因此，本研究拟将微波技术引入到脱钙骨的制备过程中，以传统制备方法为对照，考察微波技术对脱钙骨的钙含量、孔隙率、孔径大小、压缩模量等多个理化指标的影响，对微波法制备脱钙骨的可行性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：当天宰杀的同一批次猪的后腿骨，购于上海复新屠宰场，猪龄6个月。

试剂：碳酸钙、乙二胺四乙酸钠（EDTA）、氨水、氯化铵、三乙醇胺、铬黑 T指示剂、盐酸羟胺、无水乙醇、无水乙醚、Triton X-100、浓盐酸等均购于中国医药集团（上海）化学试剂公司，均为分析纯。

仪器：分析天平（AB204-N，梅特勒-托利多仪器有限公司）、微波合成仪（XH-MC-1，北京祥鹄科技有限公司）、物性测试仪（EZ-TEST，日本SHIMADZU公司）、Micro-CT（1074HR，比利时 Skyscan公司）、电热恒温水浴锅（HHS，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、Nikon显微镜（55I，日本尼康公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 脱钙骨的传统制备法

预处理：购得样品并清洗后，先将干骺端按照5mm×5 mm×3 mm的尺寸切片，然后再用高压水枪冲洗除去骨片孔隙中的骨髓，使切片呈乳黄色孔隙结构。

脱钙骨的制备流程如图1所示。预处理后的猪后腿骨干骺端首先放在5％的Triton X-100溶液中脱细胞48 h（每12 h换液一次），后用蒸馏水冲洗0.5 h；之后置于无水乙醚中脱脂48 h（每12 h换液一次），后蒸馏水冲洗0.5 h；接着置于0.6 mol/L盐酸溶液中进行脱钙12 h，然后蒸馏水冲洗0.5 h；最后脱钙后的脱钙骨置于恒温干燥箱中30℃干燥12h，最终得到脱钙骨成品。

图1 脱钙骨制备流程示意图Fig.1 Flow diagram of the preparation of demineralized bone matrix

1.2.2 微波辅助脱钙

根据脱钙骨制备的工艺，在脱钙处理环节中采用微波技术进行辅助脱钙。微波脱钙的试验条件为：微波功率300 W，微波处理时间：0～2 h。处理猪骨切片数量为60片，采用微波辅助脱钙技术制备60片脱钙骨基质用于对其理化性质的研究。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 脱钙率

采用EDTA滴定法，在参考文献［9］的基础上加以改进。具体过程如下：称取一定量的脱钙骨样品（ms），至烧杯中加入1∶1浓盐酸（6 mol/L）10 mL；盖上玻片，电炉加热至沸腾，反复三次至样品全部溶解，用去离子水冲洗玻片，冲洗液滴加入烧杯中；将烧杯中的溶液倒入100 mL容量瓶中，冲洗烧杯三次，加去离子水至刻度，摇匀。移液管从容量瓶中吸取体积为V1的溶液分别置于三个锥形瓶中。再向三个锥形瓶中分别加入5％的三乙醇胺3 mL，氨性缓冲溶液15 mL，柠檬酸钠3 mL，铬黑 T指示剂5滴，然后用0.02 mol/L的 EDTA进行滴定，当锥形瓶中溶液的颜色由酒红色变为亮蓝色即为滴定终点，EDTA消耗的体积记为V0。

脱钙骨钙含量计算公式为

式中，X?为脱钙骨钙含量（mg/g），V0为滴定钙离子所消耗EDTA的体积的平均值（3个样品的平均值，mL），T为 EDTA的标定的浓度，ms为样品的质量（g），V1为所取样液的体积（mL）。

脱钙骨脱钙率的计算公式为

式中，K为脱钙骨脱钙率，X0为样品原有的钙含量（mg/g），X为脱钙骨钙含量（mg/g）。

1.3.2 孔隙率

采用Skyscan 1074HR型Micro-CT对脱钙骨样品进行扫描，每转动3.6°进行扫描拍照，每个样品扫描360°。扫描后利用Micro-CT的系统软件对脱钙骨进行三维重构，再利用Micro-CT的CTAN软件对三维重构后脱钙骨的孔隙率进行测量分析。

1.3.3 孔径

将脱钙骨样品进行切片，厚度在0.5 mm左右。置于载玻片上利用Nikon 55i型显微镜进行拍照，显微镜目镜为 10倍镜，物镜为 4倍镜。利用Digimizer3.1图片分析软件对孔径大小进行测量，随机选取5个区域对脱钙骨孔径大小进行测量。

1.3.4 压缩模量

采用压缩法，物性测试仪压头直径2 cm，压缩速率为0.5 mm/s。选取脱钙骨中心部位，进行压缩测量。单位MPa，以脱钙骨弹性变形区的曲线的斜率表示其压缩模量，此斜率即为应力与应变的比值。每种处理方式选3个样品进行测量，最后取平均值。

1.4 数据分析方法

应用 SPSS16.0软件进行数据处理，采用ANOVA进行 Duncan多重检验分析，并用 Excel软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 脱钙方法对脱钙率的影响

脱钙骨的脱钙率代表了脱钙骨的脱钙程度，是判断脱钙骨制备效果的一项重要指标，当脱钙率达到100％时表示完全脱钙。传统制备法及微波制备法对脱钙率的影响如图2所示。

图2 脱钙方法对脱钙骨的脱钙率的影响Fig.2 The influence of decalcification methods on decalcification rate of demineralized bone matrix

由图2可见，随脱钙时间延长，两种方法所制备的脱钙骨的脱钙率均不断提高。传统制备法脱除样品中100％的钙所需的时间为11 h，而微波制备法仅需2 h就可完成此过程，脱钙时间相对缩短了82％。微波制备法显著提高了脱钙骨的制备效率，这是因为骨头中的钙元素主要以羟基磷酸钙（Ca10（PO4）6（OH）2）的形式存在，样品的脱钙过程实际上是骨头中的羟基磷酸钙与盐酸发生化学反应：Ca10（PO4）6（OH）2+20HCl→10CaCl2+6H3PO4+2H2O，生成氯化钙从而使钙元素从骨组织中分离出来，达到了脱钙的目的。在这个反应中微波将能量以电磁波的形式传递给反应物质，使样品由内到外均能发生反应，并使分子激烈的运动，增加了分子间有效碰撞的频率，从而提高了化学反应速率，加快了羟基磷酸钙与盐酸的反应速率从而提高了脱钙效率；而传统制备法的反应则是由样品外部向内部逐渐进行，从而脱钙速度相对较慢。

2.2 脱钙方法对孔隙率的影响

作为支架材料，脱钙骨应具有较高的孔隙率，以利于细胞和生长因子在脱钙骨支架内均匀分布及生长［10］。本研究采用Micro-CT对脱钙骨进行360°二维扫描的典型结果如图3所示，之后利用Micro-CT的系统软件对扫描结果进行三维重构分析，重构出脱钙骨的截面图，结果如图4所示。利用Micro-CT扫描分析的结果，应用Micro-CT的CTAN测量软件获得了脱钙骨的孔隙率。传统方法和微波法制备的脱钙骨的孔隙率随脱钙时间的变化情况如图5所示。

图3和图4表明，微波法制备的脱钙骨具备良好的三维网状孔隙结构，且孔隙间彼此相通。脱钙骨作为支架材料孔隙率应在75％以上，才能有利于细胞的黏附及细胞外基质的生长，国内外相关文献关于脱钙骨孔隙率的报道一般在80％以上［11］，本研究中，两种方法所得到的脱钙骨的孔隙率均在85％以上，无显著差异（P＞0.05），具有良好的孔隙率。

图3 脱钙骨（微波制备法）的Micro-CT二维扫描图Fig.3 The 2-D scanning picture of demineralized bone matrix（Microwave Preparation）by Micro-CT

图4 脱钙骨（微波制备法）的Micro-CT三维重构截面图Fig.4 The 3-D reconstruction picture of demineralized bone matrix（Microwave Preparation）by Micro-CT

另一方面，由图5可见，随脱钙时间延长，两种制备方法对脱钙骨的孔隙率的影响也有所区别。微波法制备的脱钙骨的孔隙率在前15 min内迅速增大，由未脱钙时的80.06％迅速增大到86.75％，之后孔隙率随脱钙时间的延长而缓慢增加，到第2 h时脱钙完成，此时孔隙率为88.23％。而传统方法制备的脱钙骨的孔隙率在脱钙1 h内的增大较快，由未脱钙时的80.06％迅速增大到85.36％，但显著低于微波法的孔隙率变化速度，两者孔隙率变化速度差异性显著（P＜0.05）。随后，孔隙率随脱钙时间延长而缓慢增加，到脱钙完成时（11 h）孔隙率达到87.87％。

图5 脱钙方法对脱钙骨孔隙率的影响Fig.5 The influence of decalcification methods on porosity of demineralized bone matrix

脱钙骨孔隙率的增大是由于脱钙骨的钙元素被脱除后，骨中钙成分流失而造成脱钙骨表观密度减小从而孔隙率增大。与传统制备方法相比，得到相同的孔隙率时，微波法可比传统方法节省90％的时间，显著提高了脱钙骨的制备效率，且微波法与传统方法制备的脱钙骨在脱钙完成时孔隙率仅相差0.36％，无显著差异（P＞0.05），可见脱钙骨并未因微波效应造成的三维结构发生变化而影响脱钙骨的制备效果，这对微波技术在脱钙骨制备中的应用具有重要的意义。

2.3 脱钙方法对孔径的影响

作为支架材料，脱钙骨的孔径大小是一个重要的指标，孔径大小影响支架材料的成骨作用。有研究证实，支架材料的孔径大小至少为100 μm才有可能使新骨长入。本研究中应用两种方法得到的脱钙骨的孔径如图6和图7所示，图6为传统方法制备得到的脱钙骨，其脱钙率为 100％，孔隙率为87.8％；图7为微波法制备得到的脱钙骨，其脱钙率为100％，孔隙率为88.2％。由图6和图7可见，两种方法制备得到的脱钙骨具有良好的孔径结构，孔径之间彼此相连，适合细胞及细胞生长因子的附着。

在脱钙过程中，由于骨中的钙元素不断的被脱离出来，使骨小梁中的钙盐下降而造成刚度不断减小，使骨小梁中胶原膨胀拉伸而导致孔径增大。由图8可见，制备方法不同，脱钙骨的孔径随脱钙时间的变化也有一定区别。微波法制备的脱钙骨的孔径在0～15 min内呈显著增大趋势，孔径由最初的308.03 μm 增大至 341.03 μm，随后孔径随脱钙时间的变化趋缓，脱钙完成后孔径为348.41 μm。而传统制备法制备的脱钙骨孔径由最初的308.03 μm增大至340.37 μm则需要2 h，用时相对较长，脱钙终点样品的孔径大小为348.98 μm，与微波法制得的样品的孔径无显著差异（P＞0.05）。与相关报道的脱钙骨的孔径相似，本研究中应用传统方法或微波法制备的脱钙骨的孔径均在300μm之上，符合组织工程对支架材料的要求，微波法可大幅提高制备效率，同时未对脱钙骨的孔径产生负面影响。

图6 传统制备方法脱钙骨孔径观察（图中的标尺为 200 μm）Fig.6 The aperture of demineralized bone matrix with traditional preparation（The black graduated scale is 200 μm）

图7 微波制备方法脱钙骨孔径观察（图中的黑色标尺为200 μm）Fig.7 The aperture of demineralized bone matrix with microwave preparation（The black graduated scale is 200 μm）

图8 脱钙方法对脱钙骨孔径大小的影响Fig.8 The influence of decalcification methods on pore size of demineralized bone matrix

2.4 脱钙方法对压缩模量的影响

脱钙骨作为支架材料不仅要为细胞提供理想的生存环境，还要满足一定的力学性能，这样脱钙骨才能在植入人体内后起到一定支撑作用，帮助人体承担压力有助于缺损组织的愈合［10］。压缩模量是脱钙骨力学性能的一个重要指标，代表脱钙骨抵抗压力变形的能力。图9为微波法制备的脱钙骨的压缩试验曲线图，两方法对脱钙骨压缩模量影响的结果如图10所示。

图9 微波法制备的脱钙骨的压缩试验曲线图Fig.9 The transformation diagram of compression test for demineralized bone matrix prepared by microwave method

如图9所示，图中 A-B段为弹性变形区，脱钙骨在受到压缩时发生弹性形变，当外力取消时脱钙骨可恢复原来形状。B-C段为蠕变区，随着压力的增大脱钙骨的结构开始发生变化，结构逐渐受到破坏。C-D段为塑性变形区，脱钙骨的结构完全遭到破坏，随着压力的增大开始发生不可恢复的形变。脱钙骨的压缩模量就是在弹性形变区域（A-B段）内应力和应变的比值。

图10表明，两种方法制备的脱钙骨的压缩模量均随脱钙时间的延长不断降低。这是由于脱钙骨的支撑强度是由骨小梁来承担的，而骨小梁的主要成分是钙盐和胶原，当钙盐不断以离子形式脱离骨小梁时，骨小梁的支撑作用便会降低，从而使抵抗变形的能力下降，压缩模量降低。样品中的含钙量越少，则样品的压缩模量就会越低。

图10 脱钙方法对脱钙骨压缩模量的影响Fig.10 The influence of decalcification methods on the modulus of compressibility of demineralized bone matrix

在临床医学中，脱钙骨压缩模量并没有统一的标准，有研究将压缩模量在2 MPa左右的支架材料应用于试验研究中并取得了不错的效果［12］。本研究中，采用微波制备法，脱钙骨在脱除90％的钙后压缩模量仍为7.11 MPa，大于2 MPa具有更好的力学性能。同时微波法制备的脱钙骨压缩模量达到7.11 MPa仅需要20 min，而传统制备法则需要2 h以上的时间，制备时间相对缩短了83％，两者差异性显著（P＜0.05）。

3 结论

本试验考察了微波技术脱钙骨制备过程中的应用可行性。通过与传统脱钙制备方法的比较发现，微波制备法可显著缩短脱钙时间，仅需2 h就可完全脱钙，相对缩短了82％的时间；微波法制备的脱钙骨具备良好的三维网状孔隙结构，且孔隙间彼此相通，脱钙终点时，脱钙骨的孔隙率均在85％以上，孔径为348.41 μm，与传统方法制备的脱钙骨孔隙率、孔径无显著差异，适合细胞及生长因子附着生长，同时符合临床应用的力学性能要求，采用微波制备法，脱钙骨的压缩模量达到7.11 MPa仅需要20 min，有效提高了脱钙骨的制备效率。本研究证明了微波技术在脱钙骨制备中应用的可行性，对微波技术在脱钙骨制备中的应用具有重要的意义。

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