响应曲面优化超滤分离花生粕活性肽的工艺

宋 慧 苗敬芝 唐仕荣

（徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221111）

响应曲面优化超滤分离花生粕活性肽的工艺

宋 慧 苗敬芝 唐仕荣

（徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221111）

以花生粕为原料，采用双酶法酶解制备活性肽，应用不同截留分子量的超滤膜对酶解液进行分离纯化，通过单因素试验探讨原料液pH值、操作压力和时间等因素对花生活性肽超滤分离膜通量的影响，利用响应曲面法对超滤工艺条件进行优化。结果表明，最佳超滤工艺参数：选用截留分子量10kD的超滤膜，原料液pH 8.2，压力0.25MPa下，超滤38.9min，膜通量可达到27.68L/（min·m2）。超滤滤出液中氨基氮含量提高到4.6倍，氨基氮总量回收率达到90%左右，实现了样品的分离纯化与初步浓缩。说明超滤分离花生粕活性肽具有快速、方便、条件温和、操作简单等优点。

花生粕；超滤；活性肽；响应曲面；工艺研究

花生是世界上主要的油料作物之一。花生榨油后的花生粕中含有40%以上的蛋白质和人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸含量较低外，其它必需氨基酸含量均接近或超过联合国粮农组织所规定的标准，且赖氨酸含量比大米、玉米高3～8倍，其有效利用率达98.94%［1，2］。但是这一宝贵的蛋白资源绝大部分被用作动物饲料［3］，造成了资源的极大浪费。近年来研究［4，5］发现蛋白质经水解得到的肽类具有降血脂、降血压、抗氧化、防衰老等生理功能，在生命活动中有着非常重要的作用，可广泛用作药物、疫苗和食品营养制剂等。而酶解法因其条件温和、生产的肽安全性高已成为肽的主要生产方法［6］。

目前，从酶解液中分离肽类一般采用超滤法［7］，蛋白酶解物经超滤膜过滤，按照分子量截留原理，将水解物分离成不同分子量范围的肽段。超滤具有操作简便、成本低廉、试验条件温和可有效防止肽变性失活等优点，从而提高活性肽的产量和质量。本试验采用超滤技术分离花生粕蛋白酶解液中的活性肽，以膜通量为指标，探讨超滤膜分子量大小、超滤压力、时间以及酶解液pH值等因素对超滤的影响，通过响应曲面法优化超滤操作条件，提高膜通量的分离效果，为花生粕酶解液中多肽的超滤分离提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

花生粕：总蛋白质平均含量为44.75%，徐州新沂崇本堂农产品开发有限公司；

盐酸、氢氧化钠：均为国产分析纯试剂；

小试平板超滤膜设备及滤膜：FLOWMEM0250，厦门世达膜科技公司；

电子天平：FA2004B型，上海越平科学仪器有限公司；

低速大容量离心机：DL－5，上海安亭科学仪器厂；

精密pH计：PHS－3C，上海精密科学仪器有限公司；

恒温干燥箱：GZY－DH.600－Ⅱ，上海跃进医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 花生多肽的酶解制备 称取粉碎花生粕1kg加入20L蒸馏水中，50℃搅拌保温1h，调pH 8.5，加胰蛋白酶0.1kg，50℃酶解4h，再加入风味酶0.08kg。继续酶解2h，90℃灭酶10min，冷却后抽滤分离残渣，4 800r/min离心10min，测定上清液pH值及氨基氮含量。酶解上清液中氨基氮的含量为1.61mg/mL。

1.2.2 花生多肽的超滤分离 采用小试平板超滤膜设备，板式膜组件，膜材料为亲水性聚醚砜超滤膜，分子截留量分别选用5，10，30，50kD，将滤液加入超滤装置，控制操作参数，记录一定时间内透过液的体积，计算膜通量［8］。

1.2.3 单因素试验 在优选超滤膜的基础上考察超滤分离压力、时间、料液pH值等因素对膜通量的影响。

1.2.4 响应曲面法试验设计 在单因素试验的基础上，选择对膜通量影响最大的3个因素为自变量，膜通量为指标，利用Design－Expert的Box－Behnken设计响应曲面试验。

1.2.5 测定项目及方法

（1）蛋白质含量：凯氏定氮法。

（2）氨基氮含量：甲醛法。

（3）膜通量：按式（1）计算。

式中：

J——膜通量，L/（min·m2）；

V——超滤液体积，L；

A——膜有效面积，m2；

T——超滤时间，min。

2 结果与分析

2.1 超滤分离花生多肽的单因素试验

2.1.1 超滤膜的选择 以酶解上清液为原料，不调节料液pH值（初始pH值为8左右），在压力0.2MPa条件下，分别用分子量为5，10，30，50kD的超滤膜，每隔10min测量截留液体积，计算膜通量，结果见图1。

由图1可见，超滤通量随截留分子质量的增大而增加。对50kD的超滤膜，在超滤进行的前40min内膜通量随时间的延长呈快速下降趋势，之后膜通量开始趋于稳定，曲线变化平缓；对30kD的超滤膜，前20min内膜通量随时间呈快速下降趋势，之后膜通量趋于稳定。这可能是由于原料液中含有较多的大分子物质，随超滤的进行，膜面凝胶层增厚以及原料液中大分子组分的沉积，导致膜通量下降。而10kD和5kD的超滤膜的膜通量随时间变化较小，能在较长时间保持稳定过滤，且10kD的膜通量远大于5kD的超滤膜，因此选用10kD的膜作进一步研究。

图1 不同分子量膜对膜通量的影响Figure 1 Effect of different membrane on membrane flux

2.1.2 pH值对膜通量的影响 以10kD的膜为超滤膜，调节料液pH值，在压力0.2MPa条件下，超滤30min，考察原料液pH值对超滤膜通量的影响，结果见图2。

图2 pH值对膜通量的影响Figure 2 Effect of pH on membrane flux

由图2可知，随着pH值的升高，膜通量逐渐增大，当pH值为8时，膜通量达到最大，之后膜通量随pH值增大开始下降。这可能是由于原料液中含有较多的蛋白质，在等电点附近时，蛋白质分子很容易被沉积在膜表面，使透过阻力增加，膜通量显著下降；当pH值增大到偏离等电点时，膜通量升高；当pH值过高时，在较强的碱性介质中蛋白质容易发生变性，从而沉积在膜表面，降低膜通量。因此超滤料液的pH值控制在8左右较适宜。

2.1.3 压力对膜通量的影响 以10kD的膜为超滤膜，料液pH值8，改变超滤压力考察压力对超滤膜通量的影响，结果见图3。

图3 压力对膜通量的影响Figure 3 Effect of pressure on membrane flux

由图3可知，当压力为0.05～0.2MPa时，随压力的增大膜通量近似直线上升；0.20～0.25MPa时膜通量变化不大，趋于稳定；0.25MPa以后反而呈下降趋势。这可能是由于压力较低时，超滤处于压力控制区，膜通量与膜两侧压力差近似成正比；随着压力的继续增大，由于界面浓差极化现象的产生，膜通量受压差影响变小；压力继续增加时，膜表面开始形成凝胶层，随着大分子物质的沉积，凝胶层厚度增大，阻力增加，可能造成膜通量下降。因此操作压力控制在0.25MPa左右为宜。

2.1.4 时间对膜通量的影响 以10kD的膜为超滤膜，料液pH值8，0.25MPa条件下超滤，每10min测量截留液体积，计算膜通量。时间对膜通量的影响见图4。

图4 时间对膜通量的影响Figure 4 Effect of time on membrane flux

由图4可知，30min内膜通量迅速下降，因为超滤运行初期膜表面没有沉积物，阻力较小，膜通量较大，随着超滤的进行，膜表面逐渐沉积原料液中的大分子物质，形成凝胶层和产生浓差极化，膜通量迅速下降［7］；30～50min内膜通量缓慢降低趋于平缓，说明此时膜通量处于较平稳状态；50min后膜通量继续下降，可能是由于此时滤膜表面沉积了较多的大分子物质，阻力显著增大。为防止低效率运行及减少后续清洗工作的麻烦，30～50min内运行较为适宜。

2.2 响应曲面法试验分析

2.2.1 模型的建立及其显著性检验 在单因素的基础上，选取超滤压力、时间、料液pH值三因素，按照Box－Behnken试验设计方案进行试验，试验因素水平编码见表1，响应曲面试验结果见表2。

利用 Design－Expert V7.0.0通过逐步回归对试验数据（表2）进行回归拟合，得到膜通量关于超滤分离的压力、时间、料液pH值3个因素的二次多项回归方程（式（2））：

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM

表2 响应面设计与试验结果Table 2 Test design and results of RSM

由表3可知，模型具有高度的显著性（P＝0.000 3），失拟项不显著（P＝0.196 3），R2Adj＝0.919 9，信燥比13.004，远大于4，说明回归方程拟合度和可信度均较高，能够用此模型对超滤过程进行分析和预测。

表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果†Table 3 ANOVA results of quadratic regression model for response surface

2.2.2 响应面分析与优化 根据回归分析结果作响应曲面图，结果见图5～7。

由图5～7并结合表3可知，模型中的一次项压力和时间差异显著，压力、时间和pH的二次项对膜通量有极显著影响，而各因素之间的交互作用较小。表明各因素对膜通量的影响不是简单的线性关系。

图5 压力、时间及其相互作用的响应曲面图Figure 5 Response surface plot of pressure and time

图6 压力、pH及其相互作用的响应曲面图Figure 6 Response surface plot of pressure and pH

图7 时间、pH及其相互作用的响应曲面图Figure 7 Response surface plot of time and pH

为进一步确定最佳超滤工艺参数，对所得方程进行逐步回归，删除不显著项，然后求一阶偏导，并令其为0，可得最优工艺参数：原料液 pH 8.2，压力 0.25MPa，超 滤时间38.9min，膜通量可达到27.31L/（min·m2）。为检验Box－Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述优化出的工艺参数重复实验3次，其平均膜通量为27.68L/（min·m2），与理论预测值相比，相对误差约为1.35%，说明此最佳模型是可靠的，具有一定的实用价值。

对超滤滤出液和截留液作氨基氮含量分析，发现滤出液中氨基氮含量达到7.37mg/mL，比初始料液氨基氮含量提高了3.6倍；滤出液中氨基氮总量回收率达到90%左右，截留液中氨基氮总量不到10%，表明花生粕酶解液中多肽分子以小分子为主，绝大多数分子量小于10kD，经过10kD滤膜超滤以后，绝大多数肽保留在滤出液中，与大分子蛋白质等实现了良好的分离，同时实现了样品的初步浓缩，达到了分离纯化的目的，有利于花生粕多肽的进一步应用。

3 结论

试验结果表明，选用截留分子量10kD的超滤膜，具有较高的膜通量，能在较长时间保持稳定过滤。调节原料液pH 8.2，在压力0.25MPa条件下，超滤38.9min，膜通量可达到27.68L/（min·m2）。超滤滤出液中氨基氮总量回收率达到90%左右，氨基氮含量提高到7.37mg/mL，比初始料液中氨基氮含量提高了3.6倍，可同步实现花生活性肽的分离纯化与初步浓缩。

1 董文宾，杨兆艳，郑丹，等.花生蛋白的研究进展［J］.粮油加工与食品机械，2005（3）：51～52.

2 万书波，封海胜，王秀贞.花生营养成分综合评价与产业化发展战略研究［J］.花生学报，2004，33（2）：1～6.

3 杨在宾，杨维仁，谢武华，等.肽能对泌乳母猪及哺乳仔猪生产性能的比较研究［J］.当代畜禽养殖业，2007（1）：21～23.

4 刘昭明，黄翠姬，李花，等.不同链长花生蛋白肽的体外抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2009，25（6）：52～55.

5 王晓坤，侯利霞，王金水，等.花生肽的提取纯化及生物活性研究进展［J］.农业机械，2011（8）：54～57.

6 马涛，刘德明.酶法制备花生多肽工艺条件优化的研究［J］.中国粮油学报，2011，26（7）：89～94.

7 代衍峰，何志勇，陈洁，等.抗氧化性玉米肽的分离纯化及其性质［J］.食品与机械，2008，24（5）：5～8.

8 杨晓泉，张新会，陈山，等.大豆肽的分级膜分离研究［J］.华南理工大学学报：自然科学版，2003，31（5）：16～20.

Study on optimization of ultrafiltration separation of peanut peptides by response surface methodology

SONG Hui MIAO Jing－zhiTANG Shi－rong

（School of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou，Jiangsu221111，China）

Ultrafiltration separation technology of bioactive peptides from peanut meals enzymatic hydrolytic liquid was carried out with the membranes of different cut－off molecular masses by response surface methodology test.Effects of different membrane，pH of materiel liquid，operating pressure and time on membrane flux were investigated through single factor test，then three key factors affecting the membrane flux such as pH of materiel liquid，pressure and time were optimized by response surface methodology.The optimum conditions on membrane flux with ultrafiltration separation of peanut peptides were identified as the follows：the membrane with a cut－off molecular mass of 10kD，pH of materiel liquid as 8.2，operating pressure as 0.25MPa，and ultrafiltration time as 38.9min，membrane flux was up to 27.68L/（min·m2）.The content of amino nitrogen in the filtrate was up to 4.6times as it in initial raw material liquid，and the coefficient of recovery of amino nitrogen was up to about 90%.All the results showed that ultrafiltration separation method has good prospect in separation and concentration of peanut peptides because of its quick speed，convenience and mild conditions with a good selectivity and handle expediently.

peanut meal；ultrafiltration；bioactive peptides；response surface methodology；technological study

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.020

江苏省科技攻关项目（编号：BE2006308）

宋慧（1960－），女，徐州工程学院副教授。E－mail：4506402＠qq.com

2011－06－20