冠突散囊菌子囊孢子破壁方法的研究

易凤英刘素纯，2袁 潇赵 乐

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

冠突散囊菌子囊孢子破壁方法的研究

易凤英1刘素纯1，2袁 潇1赵 乐1

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

研究萌发破壁、研磨破壁、浸泡－温差－振摇破壁等方法对冠突散囊菌子囊孢子破壁效果的影响。结果表明：蒸馏水浸泡－温差－振摇法具有操作简单、经济适用、破壁率高（90.8%）的特点，是冠突散囊菌子囊孢子破壁的理想方法。

冠突散囊菌；破壁率；纤维素酶；振摇

茯砖茶具有独特的口感和明显的调理人体消化及降脂减肥的功效。冠突散囊菌（eurotium cristatum）是茯砖茶中的优势菌，与茯砖茶独特品质和保健作用的形成有着密切的联系。冠突散囊菌子囊孢子为有性孢子，其孢壁质地坚韧，耐酸碱，极难氧化分解，因此限制了对孢子内有效营养成分的准确分析。为了探究冠突散囊菌子囊孢子内的有效营养成分，必须对孢子进行破壁。目前，国内外对灵芝孢子的破壁技术进行了多方面的探讨［1－3］，但对冠突散囊菌子囊孢子的破壁技术还未见报道。本试验采用机械、化学、生物等方法分别对冠突散囊菌子囊孢子破壁工艺进行研究，为冠突散囊菌子囊孢子内有效营养成分的利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冠突散囊菌子囊孢子：菌种由益阳茯砖茶厂生产的茯砖茶中分离纯化而来，自行培养，定期收集获得；

95%乙醇：分析纯，湖南师大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

恒温水浴箱：UWB－20型，北京优晟联合科技有限公司；

分析天平：ALC－110.4型，上海精密仪器仪表有限公司；

光学显微镜：BX51型，广州思贝舒检测仪器有限公司；

恒温摇床：ZHWY－C2102型，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 萌发破壁试验 称取1.00 g冠突散囊菌子囊孢子，放入200 m L三角瓶中，加入50 mL茶叶含量为4%的茯砖茶茶汁，然后放入28℃恒温培养箱中培养48 h。每隔4 h取1 m L，用血球计数板观察计数。

1.3.2 研磨破壁试验 称取1.00 g冠突散囊菌子囊孢子放入研钵中，再加入适量石英砂进行研磨。每研磨30 min后测定破壁率。

1.3.3 浸泡－温差－振摇破壁试验

（1）乙醇浸泡－温差－振摇破壁试验：参考唐维［4］、吴华［5］的试验方法，称取2份1.00 g冠突散囊菌子囊孢子装入两个200 m L三角瓶中，分别用50 m L 75%和95%的乙醇浸泡，置－18℃冰箱中冷冻1 d后，于60℃水浴锅中水浴加热2 h。加入玻璃珠若干（玻璃珠的量或体积应超过乙醇体积的1／2），然后放入180 r／min、28℃的恒温摇床中振摇3 d，每隔1 d测定破壁率。

（2）蒸馏水浸泡－温差－振摇破壁试验：此法是在乙醇浸泡－温差－振摇破壁法的基础上，将乙醇浸泡替换为蒸馏水浸泡，其他试验步骤与1.3.3（1）相同。

1.4 冠突散囊菌子囊孢子破壁率的计算

利用血球计数的基本原理对冠突散囊菌子囊孢子破壁率进行计数［6－7］。通过光学显微镜鉴别孢子的破壁与否：未破壁的冠突散囊菌子囊孢子壁光滑完整、丰满，个体形态一致；破壁后，冠突散囊菌子囊孢子壁不完整、内容物呈不规则块状。冠突散囊菌子囊孢子的破壁率按下式计算：

式中：

R——冠突散囊菌子囊孢子破壁率，%；

A——破壁前完整孢子数；

B——破壁后完整孢子数。

2 结果与分析

2.1 萌发破壁试验的破壁效果

冠突散囊菌子囊孢子在适宜的条件下经过培养，由于萌发力的作用，其孢子壁逐渐破裂，结果见表1和图1。

表1 萌发破壁试验冠突散囊菌子囊孢子的破壁率Table 1 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in germination experiment

由表1可知，随着时间的增加，其破壁率有所提高，但就整体情况而言，破壁效果不理想。

图1 萌发48 h后的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 1 Germination Eurotium cristatum ascospores after 48 h

由图1可知，培养48 h后，冠突散囊菌子囊孢子的破壁率依然很低。

2.2 研磨破壁试验的破壁效果

冠突散囊菌子囊孢子经过研磨，在摩擦力的作用下，孢子壁被磨破，达到了一定的破壁效果（表2和图2）。由表2可知，随着研磨时间的增加，破壁率不断提高，但由于研磨属于手工操作，费时费力，且由于孢子体积微小，要达到比较高的破壁率十分困难。

表2 研磨破壁试验冠突散囊菌子囊孢子的破壁率Table 2 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in grind experiment

图2 研磨2 h的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 2 Eurotium cristatum ascospores in grind experiment after 2 h

由图2可知，研磨对破壁有一定效果，但破壁的效果并不理想，且费时费力。

2.3 浸泡－温差－振摇破壁试验的破壁效果

2.3.1 乙醇浸泡－温差－振摇破壁试验的破壁效果 采用温差和机械力的作用对冠突散囊菌孢子进行破壁，在180 r／min、28℃的恒温摇床中振摇3 d后，无论是75%还是95%的乙醇都达到了较理想的破壁效果（表3和图3～4）。由表3可知，使用75%或者95%的乙醇浸泡对破壁率的效果几乎没有影响。由图3和图4可知，经75%及95%的乙醇处理3 d后，破壁效果差不多，破壁率都比较高。

表3 75%及95%乙醇浸泡的冠突散囊菌孢子的破壁率Table 3 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in 75%and 95%ethanol

图3 75%的乙醇处理3 d后的破壁效果（放大400倍）Figure 3 Eurotium cristatum ascospores in 75%ethanol after 3 days

图4 95%的乙醇处理3 d后的破壁效果（放大400倍）Figure 4 Eurotium cristatum ascospores in 95%ethanol after 3 days

2.3.2 蒸馏水浸泡－温差－振摇破壁试验的破壁效果 用蒸馏水浸泡后再采用温差和振摇的方法，同样可达到很好的破壁效果。由表4可知，随着振摇天数的增加，破壁率也逐步上升，振摇3 d后，破壁率效果已经很理想。此法操作简单、经济方便、破壁率高，是冠突散囊菌孢子破壁的最佳试验方法。由图5可知，经蒸馏水处理3 d后，冠突散囊菌子囊孢子达到了很理想的破壁效果。

表4 蒸馏水浸泡－温差－振摇法冠突散囊菌孢子的破壁率Table 4 Broken rate of Eurotium cristatum ascospores in distilled water

图5 蒸馏水处理3 d的冠突散囊菌子囊孢子（放大400倍）Figure 5 Eurotium cristatum ascospores in distilled water after 3 days

3 讨论与结论

综合萌发破壁、研磨破壁和浸泡－温差－振摇破壁3种方法的破壁效果可以看出，3种方法对孢子破壁都有作用，但破壁效果各不相同。其中，萌发破壁试验操作较简单，但破壁效果最差；研磨破壁的破壁率比萌发破壁的破壁率要稍高，但依靠手工研磨费时费力且破壁效果不佳；采用浸泡－温差－振摇破壁法，无论是用酒精浸泡，还是蒸馏水浸泡，在振摇后都能达到很好的破壁效果。由试验可知，振摇前的温差改变为破壁提供了一定的条件，而玻璃珠撞击产生的机械力是导致孢子破壁的主要原因。

本试验还发现，无论是用酒精还是用水浸泡，酒精或水的体积与玻璃珠的体积对试验结果有很大的影响：只有当玻璃珠的体积不小于酒精或水体积的一半时，才能获得良好的破壁效果。这是因为玻璃珠因重力作用会沉在三角瓶的底部，如果玻璃珠的数量太少，则很难碰击到上层的孢子从而影响破壁效果。

采用蒸馏水浸泡－温差－振摇破壁法，试验操作简单方便，仪器设备简单，试剂药品等材料廉价，且破壁效果很好，是冠突散囊菌子囊孢子破壁的理想方法。

1 夏志兰.灵芝孢子粉生物酶破壁技术的研究［J］.食用菌学报，2005，12（1）：14～18.

2 薛艳华，史权，庞海河，等.灵芝孢子几种破壁方法比较分析［J］.植物研究，2004，24（4）：216～218.

3 张守勤，朱俊洁，王长征，等.灵芝孢子食用方法与破壁技术研究进展［J］.农业机械学报，2004，35（2）：160～162.

4 唐维.花粉破壁方法的研究进展［J］.食品与发酵工业，2003，29（2）：86～92.

5 吴华.破壁提取法的灵芝孢子破壁［J］.吉林大学学报：工学版，2004，34（2）：312～315.

6 韩文瑜.病原细菌检验技术［M］长春：吉林科学出版社，1992.

7 李淑芳，张志军，李海德.灵芝孢子破壁技术的研究［J］.食品工业科技，2008，29（9）：195～199.

Research on methods to broken eurotium cristatum ascospores

YI Feng－ying1LIU Su－chun1，2YUAN Xiao1ZHAO Le1

（1.College of food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Food Science and Biotechnology，Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan410128，China）

Germination，grind and immersion －temperature －shaking methods were used to research the different effect of broken eurotium cristatum ascospores.Distilled water immersion－temperature－shaking method is simple，economical and efficient，is an ideal way to broken eurotium cristatum ascospores.

eurotium cristatum；broken；cellulase；shaking

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.042

湖南省重大科技专项（编号：2008FJ1005）

易凤英（1982－），女，湖南农业大学研究实习员，在读硕士研究生。E－mail：453064094＠qq.com

刘素纯

2011－03－20