冬虫夏草菌室内侵染蝙蝠蛾幼虫分析

[摘 要] 冬虫夏草是蝙蝠蛾幼虫和寄生真菌中国被毛孢的复合体，是我国传统中药中的濒危物种。关于冬虫夏草及其无性型中国被毛孢已有很多研究报道，然而对于蝙蝠蛾幼虫人工接种中国被毛孢和冬虫夏草子囊孢子的侵染效果对比却鲜有报道。基于此，本研究采用中国被毛孢菌丝体和冬虫夏草子囊孢子，分别在室内人工侵染养殖蝙蝠蛾幼虫，并对侵染效果进行分析，结果表明，以中国被毛孢菌丝体悬液为菌种，接种成功率较低。

[关键词] 冬虫夏草;中国被毛孢;子囊孢子;蝙蝠蛾幼虫

[中图分类号] S567.35 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2020）07-105-2

冬虫夏草是我国传统的特色中药材，是麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫的幼虫子座上的复合物。冬虫夏草生长在低温缺氧的高山草甸上，且对环境要求非常严格，同时人们对其的掠夺式采挖导致了生态环境破坏，因此人们试图通过人工来培育冬虫夏草，充分发挥其经济价值和生态价值。

目前，人们尚不清楚冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的机制。杨大荣等指出，冬虫夏草菌主要是通过子囊孢子黏附幼虫新嫩表皮的方式进入其体腔从而形成冬虫夏草[1]。本试验采用冬虫夏草的有性型子囊孢子和无性型中国被毛孢菌丝体这两种接种体分别对寄主幼虫进行侵染比较，为冬虫夏草安全性研究方面以及人工培育子实体方面提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 虫种。3龄虫草蝙蝠蛾幼虫，采自四川省德阳县虫草基地，室内人工短期饲养。

1.1.2 菌种。一是天然有性型菌种。采自青海省玉树藏族自治州的天然冬虫夏草经人工诱导其弹射、收集得到具有侵染能力的冬虫夏草子囊孢子。二是固体培养无性型菌种。中国被毛孢（Hirsutella.sinensis）寄主是蝙蝠蛾幼虫，菌种采自青海青沙山。

1.1.3 培养基。固体培养基成分包括蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、麦芽糖10 g/L、琼脂20 g/L、无水硫酸镁1.5 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、柠檬酸三铵0.4 g/L、南京白敬宇制药有限责任公司生产的复合维生素B片4片/L，蒸馏水定容至1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 蝙蝠蛾幼虫饲养。在已灭菌的9 cm×12 cm养虫盒里铺上适宜幼虫生长的高山草甸土，并种上幼虫取食的植物珠芽蓼块根（所有的土壤以及食物都要经过紫外照射严格灭菌）。待植物成活后，把蝙蝠蛾幼虫移入器皿内，每个器皿饲养两只幼虫。空气湿度控制在70%～85%，温度控制在10～16 ℃，土壤含水量控制在40%～50%，避光饲养，每隔15 d换1次器皿与饲料。

1.2.2 虫草子囊孢子的获取。在不同的玻璃平皿内分别将子座膨大的新鲜虫草标本的虫体部分用灭菌的脱脂棉进行保湿，子座头部悬于灭菌的载玻片上，置于16 ℃，光周期为12L∶12D的条件下进行诱导培养，5～10 d后可释放子囊孢子。

1.2.3 斜面菌种培养。用已灭菌的接种针挑取少量实验室固体斜面培养基保存的菌种接种到新的斜面培养基上，置于18 ℃培养箱中培养，待菌落呈圆形凸起，颜色由灰白色转浅黄褐色至黄褐色时置于4 ℃冰箱备用。

1.2.4 菌丝体悬液及子囊孢子悬液的制备。用已灭菌的接种针挑取少量培养的中国被毛孢菌丝体，置于无菌水中并用高速分散器打散，制成菌丝液备用。收集天然冬虫夏草弹射在无菌载玻片上的子囊孢子，用已灭菌的涂布器将其刮入无菌水中，摇匀后备用。

1.2.5 接种培养

1.2.5.1 接种体。为研究冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的机制，本研究分别以菌丝体悬液、子囊孢子悬液为接种体，每次分别侵染50只蝙蝠蛾幼虫。

1.2.5.2 接种方式。考虑到蝙蝠蛾幼虫几天就蜕皮一次，而蜕皮可能对浸湿侵染不利，故本试验选择在浸蘸接种后进一步采取穿刺接种法并同时将菌液混入幼虫食物中，以增加侵染成功率。

1.2.6 接种后处理。接种后将幼虫放入事先编号的已灭菌的培养皿中，仅饲喂少量珠芽蓼，置于恒温培养箱中，于16 ℃避光条件下培养。2 d后继续给予珠芽蓼并注意补充无菌水以保湿培养，5 d后转入土壤中继续饲养。每隔4 d检查统计幼虫死亡情况并加入少量珠芽蓼（珠芽蓼均要求进行紫外照射、灭菌消毒）。

2 结果与分析

2.1 子囊孢子收集

将冬虫夏草子实体的可孕部分横切制片镜检，在显微镜下，可观察到子囊细长，（247.0～420.0）μm×（7.0～10.0）μm，一端或两端略尖，直或稍弯，子囊壁薄且透明。在子囊孢子发育初期可以明显看到每个子囊里有1～8个子囊孢子，初期的子囊孢子呈球形或椭圆形，一个接一个地紧密排列在子囊中。有些含有子囊孢子的子囊比无子囊孢子的子囊要长。随着子囊的发育，孢子逐渐伸长成为长椭圆形或丝状，一个子囊中最终仅有一两个或者是4个子囊孢子发育成熟并弹射出来。当发现载玻片上有灰白色细粉状物时，用沾有无菌水的接种环黏取粉状物制成子囊孢子悬液，境检会看到典型的冬虫夏草长椭圆形或丝状子囊孢子。

2.2 菌种培养

中國被毛孢菌株生长缓慢，在固体培养基上，18 ℃黑暗条件下培养180 d，菌落呈圆形凸起，坚硬，颜色呈灰褐色至黄褐色，且会产生黄褐色至暗褐色素渗入培养基中。

2.3 接种培养

2.3.1 子囊孢子悬液接种。供试幼虫经过冬虫夏草的有性型子囊孢子悬浮液接种后60 d左右开始僵化死亡，用解剖刀剖开僵虫镜检，可见僵虫体腔内部分布大量菌丝（菌核），保湿培养一段时间后，白色菌丝体逐渐布满僵虫外表面。虫体内部菌丝（菌核）形态较一致，菌丝多分叉，并有菌丝缠绕形成的结节（菌核）（见图1B），从形态学上观察该菌丝（菌核）与冬虫夏草体内的菌丝（菌核）较相似（见图1A）。

2.3.2 中国被毛孢菌丝体悬液接种。供试幼虫经过冬虫夏草的无性型中国被毛孢菌丝体悬浮液接种40 d左右就出现幼虫僵硬死亡，有些虫体表面菌丝较少，有些僵虫体表有较多白色菌丝，甚至出现绿色孢子或孢梗束，显然后者为杂菌感染。

挑取僵虫组织或体表的菌丝制片，在显微镜下观察。在放大10×40倍时，可看到有些僵虫上菌丝或组织样品中有典型的球孢白僵菌产孢结构，有些有绿僵菌或拟青霉产孢结构，因此剔除这些非目标菌感染样品。余下的中国被毛孢无性型侵染所得的僵虫体内可见有大量的菌丝体和菌核，形态较一致（见图2B），从形态学上观察与冬虫夏草较相似（见图2A）。

3 结论

本试验通过人工收集天然冬虫夏草弹射的子囊孢子并将制得的子囊孢子悬液作为接种体，用于侵染蝙蝠蛾幼虫，最终通过形态学观察发现在接种后60 d左右开始形成僵虫，保湿培养一段时间后，僵虫外表面出现菌丝，用解剖刀剖开僵虫，制片镜检可以观察出由子囊孢子悬液侵染所得的僵虫体内有大量的菌丝（菌核），形态一致，菌丝分叉有结节，从菌丝形态学上观察与冬虫夏草菌丝（菌核）较相似。将制得的中国被毛孢菌丝体悬液作为接种体时，在采用同样的接种方式进行侵染以后40 d左右形成僵虫，有些虫体表面菌丝较少，有些杂菌感染的僵虫表面菌丝较多，甚至有孢梗束以及白色或其他颜色的孢子，表明以中国被毛孢菌丝体悬液为菌种接种成功率较低。给蝙蝠蛾幼虫人工接种中国被毛孢较易污染杂菌，如果没有进一步分析而将其盲目用作冬虫夏草的替代品，可能存在安全隐患。在进行大规模人工培养冬虫夏草及其替代品的实际操作中，对于如何避免杂菌污染，从而确保其产品的有效性和安全性仍需要深入研究。

参考文献

[1]杨大荣，沈发荣，杨跃雄，等.虫草蝠蛾生态学的研究Ⅲ.幼虫越冬与生理调节[J].动物学研究，1988（s1）：43-49.

作者简介：韩晓然（1992—），女，农学硕士，研究方向：森林保护学。