香鱼凝血因子X基因表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

黄左安, 陈 炯, 陆新江, 史雨红, 李明云

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实室, 浙江 宁波 315211)

香鱼凝血因子X基因表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

黄左安, 陈 炯*, 陆新江, 史雨红, 李明云

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实室, 浙江 宁波 315211)

凝血途径的关键因子——凝血因子X (coagulation factor X, FX), 是一种与免疫调控密切相关的维生素K依赖型丝氨酸蛋白酶。该研究克隆了香鱼 (Plecoglossus altivelis) FX基因全长cDNA序列, 它由1 817个核苷酸组成, 包含一个大的开放阅读框, 编码一个由453个氨基酸组成的相对分子质量为5.07 × 104的蛋白。香鱼FX与已知的哺乳动物FX的结构相似, N端24个残基为信号肽序列。序列比较表明, 香鱼FX与斑马鱼FX的氨基酸同一性最高, 为53%。在健康香鱼中, FX基因mRNA主要在肝组织中表达, 脑和鳃中也有少量表达。实时荧光定量PCR分析揭示, 鳗利斯顿氏菌感染后香鱼肝组织中FX基因mRNA表达显著上调, 16 h时达到5.43倍。通过原核表达系统表达了香鱼FX丝氨酸蛋白酶结构域, 并制备了抗血清。Western blotting分析显示, 鳗利斯顿氏菌感染后香鱼血清中FX含量显著增加, 并随着时间延长上调倍数不断增大, 在36 h时达到3.68倍。据此, FX基因mRNA及蛋白的表达与鳗利斯顿氏菌感染香鱼的过程紧密相关, 揭示它可能在鱼类抗细菌感染的免疫反应中起重要作用。

凝血因子X; 香鱼; 鳗利斯顿氏菌; 实时荧光定量PCR; Western blotting

凝血因子X (coagulation factor X, FX) 是动物内源性和外源性凝血途径共同通路的关键酶(Krupiczojc et al, 2008)。在机体受伤出血时, FX被激活转变为FXa, 能与FVa、Ca2+、磷脂共同作用将凝血酶原转化为凝血酶, 从而发挥凝血效应(Borensztajn et al, 2008)。此外, FX在免疫方面发挥着非常重要的作用。FXa能激活蛋白酶激活受体-1 (PAR-1)和蛋白酶激活受体-2 (PAR-2), 参与免疫调控维持机体免受病原体侵害 (Schoenmakers et al, 2005; Borensztajn & Spek, 2011); FXa能诱导人脐静脉内皮细胞白介素-6 (IL-6) 和促炎细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) 的表达, 与炎症反应相关(Cirino et al, 1997; Papapetropoulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004); FX参与补体系统功能中心C3的激活, 从而参与补体系统涉及的免疫过程(Amara et al, 2008)。近年来, 哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类等多个物种的 FX基因序列已被测定(Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; St Pierre et al, 2005; Kimura et al, 2009; Jima et al, 2009; Leong et al, 2010)。

香鱼 (Plecoglossus altivelis) 隶属胡瓜鱼目香鱼科, 是东亚地区中国、日本和朝鲜等国家特有的一种小型经济名贵鱼类。高密度人工养殖导致病害频繁发生, 其中鳗利斯顿氏菌 (Listonella anguillarum) 是养殖香鱼的主要病原菌之一, 造成巨大的经济损失 (Li et al, 2009)。人工养殖香鱼以无污染和绿色健康为特色, 抗生素和农药防治病害受到诸多限制。因此, 迫切需要深入研究香鱼免疫相关基因来指导香鱼病害防治 (Uenobe et al, 2007; Chen et al, 2008)。由于FX基因在动物免疫反应中起重要作用, 我们拟对其进行研究。本实验通过文库随机测序结合cDNA末端快速扩增 (RACE)的方法成功获得香鱼FX基因的cDNA 全序列, 明确了它的序列特征、系统进化关系和 mRNA 的组织表达特征, 并原核表达制备了抗血清, 随后分别用实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blotting研究了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼肝组织 FX基因mRNA和血清FX蛋白的表达变化, 为进一步深入研究FX 在鱼类抗细菌免疫中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

健康香鱼个体体重 20～25g, 购自宁波水产大世界。大肠杆菌TG1菌株和载体pBluescript SKII (+)由本实验室保存。RNAiso试剂、Oligotex-d T30＜super＞ mRNA Purification Kit、AMV逆转录酶、Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、cDNA Library Construction Kit和SYBRPremixEx Taq试剂盒均购自 Takara公司; Gel Extraction Kit购自Omega公司; 引物合成及序列测定由上海英骏生物工程公司完成; 二抗 (辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG)购自北京中山金桥生物技术有限公司; ECL化学发光试剂盒、显影定影试剂盒、柯达X-OMAT BT胶片和压片暗盒购自碧云天生物技术研究所。ICR小鼠购自宁波大学医学院实验动物中心。鳗利斯顿氏菌香鱼分离株ayu-H080701由本实验室保存。

1.2 香鱼FX基因cDNA序列的获得

提取健康香鱼肝脏总 RNA, 经 1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测完整性, 紫外分光光度计进行纯度分析。用Oligotex-dT30纯化mRNA, 以其为模板, 采用cDNA Library Construction Kit构建香鱼肝cDNA文库, 具体方法参照厂家说明。随机挑取287个插入片段≥800 bp 的克隆进行序列测定。将获得的cDNA序列通过 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)与 GenBank中的序列进行比较分析,筛选与已知物种 FX基因相似的部分序列, 并用RACE技术获得香鱼FX全长cDNA序列。

1.3 序列分析

信号肽序列预测采用 SignalP 3.0系统 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 多重序列比对采用ClustalW程序 (http://clustalw.ddbj.nig. ac.jp/), 系统进化树构建采用MEGA 4.0 (Tamura et al, 2007)。

1.4 香鱼FX基因mRNA的组织表达特征分析

采用RNAiso试剂提取香鱼各组织总RNA, 并用DNase I (RNase-free) 进行处理。取1 µg总RNA为模板, oligo (dT)30为引物, 用AMV逆转录酶在42 ℃作用1.5 h, 合成第一链cDNA。根据已获得的香鱼 FX基因 cDNA序列设计引物, FXtest (+): 5′-CCACCCACTTCAAAGTATGCC-3′和FXtest (-):5′-TGACATGGGTGAGAGCAGCA-3′, 预期扩增片段长度为386 bp; 根据香鱼看家基因β-actin cDNA序列(AB020884) 设计引物, pActin2 (+): 5′-TCGTGCGT GACATCAAGGAG-3′和pActin2 (-): 5′-CGCACTTC ATGATGCTGTTG-3′, 预期扩增片段长度为231 bp。PCR反应体系为25 µL, 包括cDNA 模板0.5 µL, 10× Ex PCR 缓冲液2.5 µL, dNTP混合物 (各2.5 mmol/L) 2 µL, 正向和反向引物 (10 µmol/L) 各1 µL, Ex Taq DNA 聚合酶(5U/µL) 0.25 µL 和灭菌水17.75 µL。PCR 反应条件为: 94 ℃预变性；2 min 后按下列程序进行30个循环, 每个循环包括94 ℃变性30 s, 58 ℃ 退火30 s, 72 ℃延伸30 s；循环结束后72 ℃延伸10 min。PCR产物用2%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 鳗利斯顿氏菌侵染的香鱼肝 FX基因 mRNA表达变化

取鳗利斯顿氏菌感染后不同时间香鱼肝组织,检测FX基因mRNA转录水平的变化。参照RNAiso操作说明书, 对每组的5条香鱼肝组织总RNA进行提取, 并将同一组的 RNA进行等量混合。第一链cDNA合成, RT-qPCR的引物序列同1.4。25 μL PCR的反应体系包括SYBRPremix Ex Taq(2×) 缓冲液12.5 μL、引物各1 μL、模板0.5 μL、灭菌水10 μL。扩增反应在Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪上进行, 程序为94 ℃ 180 s (1个循环), 随后进入扩增阶段, 共40个循环, 每一循环包括: 94 ℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。为确保特异性扩增, PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析, 条件是94 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 95 ℃ 30 s (1个循环)。为保证PCR结果的准确性, 每一个样品重复分析 3次, 包括目标基因 (FX)和看家基因 (β-actin)。荧光定量的结果采用仪器自带程序 MxPro 3.2读取。根据 Livak & Schmittgen (2001)提出的相对标准曲线法2-ΔΔCt对相对定量的结果进行分析, 获得香鱼肝组织 FX基因mRNA的相对表达量。

1.6 香鱼FX的原核表达和抗血清制备

由于香鱼FX全长基因在pET28a、pET22b、pET15b、pSBET等载体中均不表达。因此, 我们选择性表达香鱼FX丝氨酸蛋白酶结构域。设计引物对 pET-FX (+): 5′-CCATATGATCCAAATCCATAAG ATCTATAT-3′和pET-FX (-): 5′-GGGATCCTCAAGG TTGGGGATAAACAGCA-3′ (下划线为添加的限制性内切酶NdeI和BamH I的识别序列), 以cDNA为模板PCR扩增获得目的片段, 扩增产物经1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后, 用QIAquick Gel Extraction纯化。纯化产物用NdeI和BamH I双酶切后, 插入到同样双酶切的原核表达载体 pSBET中, 获得重组质粒pSBET-FX。pSBET-FX转化大肠杆菌BL21 pLys E菌株, IPTG 诱导表达, 细菌裂解产物经SDS-PAGE电泳分离, 考马斯亮蓝G-250染色检测表达情况。

重组菌体大量诱导后, 经 12% SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次分离, 用0.25 mol/L KCl染色后, 切下目的条带用以免疫小鼠。共免疫3次, 每次间隔一周。于第3次免疫后的第3天眼动脉取血, 4 ℃静置4 h以上, 冷冻离心后取上清, 分装后保存于-70 ℃备用。

1.7 Western blotting检测

香鱼尾静脉抽取血浆后于4 ℃静置4 h, 冷冻离心取上清, 将上清样品用 Bradford法定量(Bradford, 1976)。0 h对照、4、8、12、16、24和36 h的血清蛋白样品经5%浓缩胶 (100 V, 1 h) 和12%分离胶 (130 V, 2 h) 电泳, 将凝胶放置于等面积的已润湿的 NC膜上, 然后夹在滤纸中, 滤纸上下各三层, 湿转法35 V转移3 h。转膜结束后, 用10%脱脂奶粉的 PBS-T 37 ℃封闭 2 h。随后一抗4 ℃孵育过夜, 一抗用 5%BSA和 0.02%叠氮钠的PBS-T稀释。一抗结束后, 将NC膜用PBS-T 15 min洗一次, 5 min三次。然后加入相应的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG (用PBS-T 1∶5 000稀释), 37 ℃温浴1 h。再用PBS-T 15 min洗一次, 5 min四次, 加上ECL于暗室显影。条带用Quantity One软件进行灰度值计算。

2 结 果

2.1 香鱼FX基因cDNA序列分析

287 个随机挑选的克隆中共筛选到 8个阳性克隆, 经测序分析, 与已知其他动物 FX基因具有较高的同源性, 且这些序列彼此间同源性＞99%。随即用RACE方法获得了香鱼FX基因全长cDNA序列 (EMBL登录号: FR851398)。 它由1 817个核苷酸组成, 3′-末端具有poly(A) 尾, 含一个大的开放阅读框, 起始于第234～236 位的ATG起始密码子, 终止于第1 593～1 595位的TGA终止密码子, 推测编码一个由 453个氨基酸组成、相对分子质量为 5.07 × 104的蛋白。分析表明,序列的3′-端非编码区长222个核苷酸, 多腺苷酸化信号序列“AATAAA”位于第1 801～1 806位 (图1)。香鱼FX的N端24个氨基酸为信号肽序列, 其氨基酸序列还包括γ-羧基谷氨酸结构域 (Ala 43～Val 88)、两个EGF-like结构域 (Asp 89～Glu 125、Ser 129～Cys 167) 和丝氨酸蛋白酶结构域 (Glu 190～Lys 437) 三种保守的结构域, 其中γ-羧基谷氨酸结构域中包含10个保守的γ-羧基谷氨酸。

全长氨基酸序列比较表明, 香鱼 FX与斑马鱼FX同一性最高, 为53%, 与大西洋鲑FX的同一性为48%, 而与哺乳动物FX的同一性为44%～46%。系统进化树分析表明, 鱼类、哺乳动物、鸟类和爬行类FX分别成簇 (图2)。

图1 香鱼FX基因cDNA核苷酸序列和预测的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequences of ayu FX cDNA and deduced amino acid sequences

图2 基于NJ法构建香鱼和其它动物全长FX蛋白氨基酸序列的系统进化树Fig. 2 FX phylogenetic tree of ayu and other animals based on NJ method

2.2 香鱼FX基因mRNA的组织表达特征

取健康香鱼肝、脾、肾、脑、心、鳃、肌肉和肠进行RT-PCR检测, FX扩增产物为386 bp, 内参β-actin为231 bp。RT-PCR结果表明, 健康香鱼FX基因mRNA主要在肝中表达, 在脑和鳃中也有微量表达 (图3)。

2.3 鳗利斯顿氏菌侵染前后香鱼 FX基因 mRNA的表达变化

鳗利斯顿氏菌感染的香鱼呈现出肌肉腐烂, 肠道、鳃盖和鱼鳍基部充血发红等典型的细菌败血症症状, 而对照香鱼 (注射生理盐水) 未表现出任何异常现象。由于香鱼FX基因mRNA主要在肝中表达。因此, 我们选取鳗利斯顿氏菌感染香鱼4、8、12、16、24和36 h的肝组织, 进行RT-qPCR分析。结果表明, 与对照组相比, 4 h时, 染病香鱼FX基因mRNA的表达量无明显变化; 8 h后, 表达量显著增加 (P＜0.05); 16 h时, 表达量达到峰值 (P＜0.05),约为对照组的5.43倍(图4)（ANOVA,t-test）。

图3 香鱼FX基因mRNA的组织表达特征Fig.3 The mRNA expression patterns of ayu FX

图4 利斯顿氏菌感染前后香鱼肝组织中FX基因mRNA的表达变化Fig. 4 Analysis of liver FX mRNA expression changes post L anguillarum infection in ayu.

2.4 香鱼FX基因丝氨酸蛋白酶结构域的原核表达

原核表达质粒 pSBET-FX经测序验证无误后,在大肠杆菌 BL21 pLys E中经 IPTG诱导表达, SDS-PAGE分离菌体蛋白, 出现一条高表达的诱导蛋白带, 相对分子质量为2.3×104左右 (图5 a), 与预测的香鱼 FX丝氨酸蛋白酶结构域相对分子质量大小 (2.26×104) 相符。该片段切胶纯化后免疫小鼠,制备抗血清。

图 5 香鱼 FX丝氨酸蛋白酶结构域原核表达和 Western blotting分析Fig. 5 Prokaryotic expression and Western blotting analysis of serine proteinase domain of FX

2.5 Western blotting检测香鱼血清中FX的含量变化

取4、8、12、16、24、36 h和对照香鱼血清蛋白进行Western blotting分析, 在血清中检测到相对分子质量为4.81×104的条带(图5 b)。与健康对照相比, 4 h时, 鳗利斯顿氏菌侵染的香鱼血清中FX的含量未发生明显变化; 8 h后含量显著增加(P＜0.05), 并随着感染时间延长含量持续增加, 8 h时为对照组的2倍, 36 h时为对照组的3.68倍 (图6)。

3 讨 论

FX广泛存在于脊椎动物中。本实验通过文库随机测序结合RACE的方法, 成功获得了香鱼FX基因cDNA全长序列, 这是香鱼FX基因cDNA 序列的首次报道。推测的编码蛋白具有γ-羧基谷氨酸结构域、EGF-like 结构域和丝氨酸蛋白酶等动物FX特征性结构域, 它与其它物种的氨基酸同一性小于53%。香鱼FX基因mRNA主要在肝组织中表达, 这与哺乳类等物种的报道结果一致 (Pendurthi et al, 1997; Heidtmann & Kontermann, 1998; Borensztajn et al, 2008)。氨基酸序列系统进化树分析揭示, 香鱼FX 与斑马鱼FX的进化相关性最高,且与其它物种FX的进化关系与动物本身的进化分类相吻合, 揭示了FX在进化过程中的保守性。

图6 香鱼血清FX Western blotting检测Fig. 6 Western blotting analysis of ayu serum

鳗利斯顿氏菌是养殖香鱼出血性败血症的主要病原之一, 由其引起的病害给香鱼产业造成了巨大的经济损失 (Li et al, 2009)。本实验研究表明, FX基因的mRNA表达及血清中FX的蛋白含量变化均与鳗利斯顿氏菌侵染香鱼的过程紧密相关, 这在鱼类中是首次报道, 揭示了 FX很可能在鱼类抗细菌侵染的免疫反应中起作用。结合前人对哺乳动物FX的研究结果, 我们推测鱼类 FX在此病程中的作用如下: 1) FX作为动物内源性和外源性凝血途径共同通路的关键酶 (Krupiczojc et al, 2008), 首要功能是促进凝血 (Borensztajn et al，2008)。细菌感染的急性期反应特征之一是病原菌感染宿主动物后短时间内, 宿主血液中的纤维蛋白原在凝血酶的作用下迅速形成纤维蛋白, 并于炎症区组织间隙构成网状物或凝块, 以阻止病原菌及其毒性产物的扩散。因此, FX的表达上调可能起促进凝血, 缓解病情的作用。我们之前对香鱼抗凝血酶 (antithrombin, AT)基因的研究也表明, 到12 h时, 细菌侵染组香鱼的肝AT基因mRNA表达与健康组相比显著下调 (Li et al, 2011), 已知AT和FX的作用相互拮抗。因此,我们认为侵染前期FX基因mRNA的表达上调与AT基因mRNA的表达下调的目的是一致的, 均有利于凝血系统发挥作用。有意思的是, 两个基因mRNA的表达均在16 h时显著增加, 这可能是由于凝血和纤溶系统过度激活容易导致弥散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)而给机体造成严重损伤。因此, 在 FX显著上调的同时, AT也从前期的表达下调转变为显著上调, 两者的作用相互拮抗, 以避免凝血系统的过度激活。2) 哺乳动物研究发现, FXa能诱导人脐静脉内皮细胞IL-6和MIF的表达 (Cirino et al, 1997; Papapetropo ulos et al, 1998; Shimizu et al, 2004 ); 或参与激活补体系统C3 (Amara et al, 2008)。一些鱼类研究也表明病原菌感染后, IL-6、C3和MIF的表达量均上调 (Bird et al, 2005; Chen et al, 2008; Wang, 2010), 我们抑制消减杂交的结果也表明鳗利斯顿氏菌侵染8 h后, 香鱼肝组织中补体系统成分, 如 C4、C5、C8、C9、Cfh、Cfb等基因 mRNA均显著表达上调 (结果未发表)。然而,鱼类 FX是否介导病原菌感染后上述细胞因子及补体系统成分的表达增加尚有待于进一步证明。

综上所述, 本研究首次报道了鱼类凝血因子 X基因表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性, 为鱼类FX的结构、功能和作用机制的深入研究奠定了基础。

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Alteration on the expression of ayu coagulation factor X gene uponListonella anguillaruminfection

HUANG Zuo-An, CHEN Jiong*, LU Xin-Jiang, SHI Yu-Hong, LI Ming-Yun

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo University,Ningbo, 315211China)

Coagulation factor X (FX) plays an important role in the immune response of mammals. In this study, the full length cDNA sequence of the ayu FX gene, 1817 bp in length excluding 3'-polyA tail, was determined for the first time. The sequence contained an open reading frame, which encoded a protein of 453 amino acids with a molecular weight of 5.07 × 104. The predicted protein had motifs typical of animal FX, and its N-terminal 24 residues were the signal peptides. Sequence comparison showed that ayu FX shared 53% amino acid sequence identity with zebrafish FX. In healthy ayu, FX mRNA was expressed mainly in the liver and weakly in the brain and gill. AfterListonella anguillaruminfection, liver FX transcriptions significantly increased, and peaked at 16 h post infection. The serine protease motif of ayu FX was expressed inEscherichia coliand was subsequently used for antiserum preparation. Western blotting analysis revealed that serum FX significantly increased in bacterially infected ayu fish. In conclusion, the ayu FX gene expression was significant in the progress of bacterial infection, which suggests FX’s role in fish immune response.

Coagulation factor FX; Ayu;Listonella anguillarum; RT-qPCR; Western blotting

Q917.4; Q959.499

A

0254-5853-(2011)05-0492-07

D OI: 10.3724/SP.J.1141.2011.05492

2011-05-09; 接受日期:2011-07-08

长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0734); 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-08-0928); 宁波市自然科学基金项目(2010A610001)

∗通讯作者(Corresponding author), Tel: 0574-87609571, E-mail: jchen1975@163.com

黄左安(1988—), 男, 浙江温州人, 硕士生, 研究方向:水产分子生物学; Tel: 13958231636; E-mail: hzaok@163.com