青春期小鼠与成年小鼠在吗啡和食物诱导条件化位置偏爱建立上的异同

戚仁莉, 瞿家桂, 陈艳梅, 马原野,, 胡新天,

(1. 中国科学技术大学 生命科学学院, 安徽 合肥 230026; 2. 中国科学院昆明动物研究所, 云南 昆明 650223; 3. 中国科学院生物物理研究所 脑与认知国家重点实验室, 北京 100101; )

青春期小鼠与成年小鼠在吗啡和食物诱导条件化位置偏爱建立上的异同

戚仁莉1,2, 瞿家桂1,2, 陈艳梅2, 马原野1,2,3,*, 胡新天1,2,3,*

(1. 中国科学技术大学 生命科学学院, 安徽 合肥 230026; 2. 中国科学院昆明动物研究所, 云南 昆明 650223; 3. 中国科学院生物物理研究所 脑与认知国家重点实验室, 北京 100101; )

该实验通过采用吗啡诱导的条件位置偏爱(conditioned place preference, CPP)与食物诱导CPP相结合的方法来研究青春期小鼠和成年小鼠的普通学习记忆和成瘾学习记忆之间是否存在差异。结果发现: 1)成年小鼠能够建立吗啡诱导 CPP, 而青春期小鼠不能建立; 2)青春期小鼠和成年小鼠都能够建立食物诱导 CPP。吗啡诱导 CPP的结果提示, 青春期小鼠和成年小鼠在成瘾学习记忆上有差异, 青春期小鼠的成瘾记忆能力较弱。食物诱导 CPP的结果提示, 青春期小鼠和成年小鼠在普通学习记忆上没有差异。吗啡诱导CPP和食物诱导CPP的结果比较提示,小鼠的普通学习记忆系统和成瘾学习记忆系统发育进程是不平行的。

青春期; 成年; 吗啡; 食物; 条件化位置偏爱

药物成瘾是一个复杂的生物学过程。学习记忆参与药物成瘾过程(Nestler 2001; Kelley 2004)。与成瘾相关的线索, 如与用药相关的人物、地点或暗示等, 都可能诱导出觅药和用药行为。目前实验室广泛采用条件化位置偏爱(conditioned place preference, CPP)模型来研究动物线索诱导的药物依赖行为。CPP实质上是以巴甫洛夫条件反射为基础的一种行为学习和记忆过程。通过把奖赏刺激与非奖赏中性刺激(如某特定环境)反复联系起来之后, 非奖赏性的中性刺激便可以诱导出奖赏效应。药物、食物、性活动等奖赏刺激都可以诱导出 CPP, 但成瘾药物诱导CPP所检测的成瘾记忆和食物诱导CPP所检测的普通记忆可能是两个不同甚至相拮抗的记忆系统。之前我们实验室研究发现大鼠腹腔注射阻断学习记忆的东莨菪碱明显抑制了食物诱导 CPP的建立, 但是对于吗啡诱导 CPP不仅没有抑制作用,而且高剂量下还具有强化作用(Tan et al, 2007)。在CPP条件训练后, 药物诱发大鼠的癫痫持续状态会阻断大鼠食物诱导CPP的建立, 但对吗啡诱导CPP却没有影响(Zhang et al, 2009)。

学习记忆系统是随神经系统发育而不断完善的。青春期是一个特殊的发育阶段, 啮齿类动物青春期大约是从出生后28～42 d(Spear et al, 1983)。这个时期的啮齿类动物前额叶中有大量NMDA受体和突触连接在消退(Guilarte, T.R., 1998), 杏仁核(Berdel et al, 1996)和海马(Dumas & Foster, 1998; Wolfer & Lipp, 1995)尚未发育成熟, 中脑-边缘系统和伏隔核的多巴胺合成水平较低(Spear, 2000)。青春期大鼠, 如出生后 35 d 的大鼠不能产生吗啡诱导CPP效应(.Bolanos et al,1996), 而成年大鼠就能够产生吗啡诱导 CPP效应(Randall et al, 1997); 但James et al(2000)研究表明, 成年与青春期大鼠的可卡因和吗啡诱导CPP都可以建立, 且两者并没有显著差异。啮齿类青春期动物是否能建立食物诱导CPP至今未见报道。在本研究中, 我们以昆明小鼠为对象, 通过比较青春期小鼠和成年小鼠吗啡及食物诱导 CPP的建立情况来检测两者的成瘾记忆及普通学习记忆是否存在差异。如果青春期小鼠的吗啡诱导CPP和食物诱导CPP都不能建立, 则说明其成瘾学习记忆和普通学习记忆系统均未发育完全,那么我们广泛采用的 CPP范式将不适用于检测青春期小鼠; 如果青春期小鼠吗啡诱导CPP不能建立而食物诱导CPP能够建立, 则说明其吗啡成瘾记忆能力较弱, 而普通记忆能力正常, 那么这两种记忆系统的发育进程则是不平行的。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性昆明小鼠购于昆明医学院[SCXK(滇2005—0008)]。其中44只为出生后60 d以上, 开始实验时体重(36.0±2.99)g; 41只为出生后23 d, 开始实验时体重(18.1±2.19)g。所有动物在标准条件下饲养, 12 h 黑暗交替(7:00—19:00为光周期)。实验在9:00—16:00之间完成。

1.2 药品

盐酸吗啡(10 mg/（mL·瓶）, 沈阳制药厂, 产品批号: 070802)

1.3 实验装置与方法

1.3.1 CPP装置 4个CPP箱, 由PVC板制作。CPP箱主要由两端两个相同尺寸(17 cm×15 cm×20 cm)的条件化箱和一个中间过渡箱(6 cm×15 cm×20 cm)组成。两个条件化箱内分别贴有黑白相间的横条纹和竖条纹, 且箱底部的粗糙程度有明显的差别, 一个粗糙; 另一个光滑。过渡箱内为灰色内壁。在两个条件化箱和过渡箱之间有可以开启和关闭的门。通过实验检测表明, 此行为检测装置不会导致实验动物先天性的位置偏爱, 统计上无差异。CPP装置被放置在单独的房间内, 装置上方悬挂有摄像头,用于记录CPP实验过程并保存在电脑内。实验记录的数据采用实验室自编软件进行统计。

1.3.2 实验方法和过程 小鼠在实验室适应环境一周后开始实验。成年小鼠被随机分为4组: 吗啡组(n=12)、盐水组(n=10)、食物组(n=11)、食物对照组(n=11); 青春期小鼠被随机分为 4组: 吗啡组(n=10)、盐水组(n=9)、食物组(n=11)、食物对照组(n=11)。

1.3.2.1 吗啡诱导的CPP实验程序

1)条件化前期(第 1～3 d): 也称适应期, 打开CPP箱小门, 每天小鼠在CPP箱内自由活动15 min (900 s)。第3天 动物在CPP箱内的行为被录像并进行数据分析。如果动物出现明显的位置偏爱, 如在一个箱内停留的时间超过总时间(900 s)的70%(630 s)或少于总时间的 30%(270 s), 该动物将会被剔除。选择动物停留时间相对较短的箱子为伴药箱与吗啡相匹配。

2)条件化期(第4～11天)：在此期间, 条件化箱门关闭, 小鼠每天在腹腔注射吗啡(40 mg/kg体重)或等体积生理盐水后, 立即进入所配对的箱子, 停留40 min。吗啡组小鼠进入伴药箱前腹腔注射吗啡,进入无伴药箱前腹腔注射盐水; 盐水组小鼠进入伴药箱和无伴药箱前都注射盐水。每天条件化训练一次。

3)条件化后期(第12天): 将CPP箱的小门打开,小鼠在箱内自由活动15 min(900 s)并录像。

1.3.2.2 食物诱导的CPP实验程序

实验前统计小鼠每天的食物消耗量并得出其基础值, 实验前 5 d 及实验期间限制小鼠摄食量(给予基础值85%的食物)。条件化前期(第1～3天)和条件化后期(第10天)与吗啡CPP程序相同。条件化期间(第4～9天), 条件化箱门关闭, 小鼠隔天进入伴食箱或无伴食箱接受40 min条件化训练。食物组小鼠训练时, 伴食箱提供 5 g 食物, 无伴食箱不提供食物; 对照组小鼠训练时, 伴食箱和无伴食箱均不提供食物。食物组小鼠在伴食箱的训练结束后, 对剩余食物称重。每天条件化训练一次。

每次小鼠实验后, 取出箱子下面的底板, 用水清洗, 再使用酒精擦拭底板和箱子的四壁, 间隔 10 min 后再进行下一次实验。

1.4 数据统计

CPP效应的考察指标采用CPP评分, CPP分数计算公式为伴药(食)箱停留的时间/[伴药(食)箱停留的时间+无伴药(食)箱停留的时间]。数据用 CPP分数平均值±标准误差(SEM)表示, 对训练前后的CPP分数采用配对t检验进行分析(Hnasko et al, 2005; Airavaara et al, 2007), 应用软件SPSS13.0对数据进行统计分析。P＜0.05为在统计上有显著性差异。

2 结 果

2.1 青春期小鼠与成年小鼠在吗啡CPP上的差异

小鼠适应期后进行连续8 d的吗啡条件位置匹配训练, 通过配对比较条件化训练前期与训练后期的CPP分数来考察小鼠能否建立吗啡诱导CPP效应。结果表明: 青春期盐水组小鼠 条件化前期与条件化后期分数没有显著差异(t=-1.654,P=0.133),青春期吗啡组小鼠条件化前期与条件化后期分数也没有显著差异(t=-1.056,P=0.318), 说明青春期小鼠在本实验使用的吗啡剂量下不能产生吗啡诱导的CPP效应(图1a)。成年盐水组小鼠条件化前期与条件化后期分数没有显著性差(t=-0.786,P=0.448), 吗啡组小鼠条件化前期与条件化后期分数存在显著性差异(t=-2.834,P=0.016), 说明成年小鼠在本实验使用的吗啡剂量下能产生吗啡诱导的CPP效应(图1b)。

2.2 青春期小鼠与成年小鼠在食物CPP上的差异

图1 青春期和成年小鼠的吗啡诱导CPP效应Fig. 1 Morphine-induced CPP effects in adolescent and adult mice

小鼠适应期后进行连续6 d的食物条件化位置匹配训练, 通过配对比较条件化训练前期与训练后期的CPP分数来检测小鼠能否建立食物CPP效应。结果表明: 青春期食物对照组小鼠条件化前期与条件化后期分数没有显著差异(t=-1.268,P=0.237),青春期食物组小鼠条件化前期与条件化后期分数具有显著差异(t=-2.477,P=0.033), 说明青春期小鼠能产生食物CPP效应(图2a)。成年食物对照组小鼠条件化前期与条件化后期分数没有显著性差异(t=-0.708,P=0.494), 成年食物组小鼠条件化前期与条件化后期分数存在显著性差异(t=-3.057,P=0.011), 说明成年小鼠也能产生很好的食物 CPP效应(图2, b)。

图2 青春期和成年小鼠的食物诱导CPP效应Fig. 2 Food-induced CPP in adolescent and adult mice

3 讨 论

青春期小鼠和成年小鼠经过连续6 d食物配对训练后都能够建立食物诱导 CPP, 说明青春期小鼠具有将环境背景和食物奖赏效应联合起来记忆的能力, CPP范式能够用于对检测青春期小鼠; 经过连续8 d吗啡配对训练后, 青春期小鼠不能建立吗啡诱导 CPP, 而成年小鼠能够建立。从青春期小鼠与成年小鼠的吗啡诱导CPP和食物诱导CPP结果的比较中可以看出, 青春期小鼠与成年小鼠在普通学习记忆上没有差异, 而在成瘾学习记忆上存在差异, 青春期小鼠成瘾记忆要弱于成年小鼠; 且在个体发育过程中, 成瘾学习记忆和普通学习记忆这两个学习记忆系统的发育进程是不平行的。

青春期小鼠与成年小鼠相比成瘾学习记忆能力较弱的特点, 可能是机体在发育过程中的一个保护措施。之前有实验支持这一观点, Doherly et al 2009)对成年大鼠与青春期大鼠的自我给药、戒断和线索诱导复吸过程进行对比研究发现, 青春期大鼠与成年大鼠在自我给药剂量方面没有差异, 但在戒断后线索诱导的觅药行为上不如成年大鼠明显, 提示在个体发育的过程中, 青春期机体消除伤害刺激的保护机制比成年期机体更强。另外, 从进化的角度来看, 普通学习记忆能力是物种得以保存的基本能力, 所以在个体发育的早期就已具备, 而成瘾学习记忆相对于生存来说是比较高级的能力,其发育进程滞后于普通学习记忆系统是可以理解的。

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Differences in morphine-induced and food-induced conditioned place preference between adolescent and adult mice

QI Ren-Li1,2, QU Jia-Gui1,2, CHEN Yan-Mei2, MA Yuan-Ye1,2,3,*, HU Xin-Tian1,2,3,*

(1. School of Life Science,University of Science and Technology of China,Hefei Anhui230026,PR China; 2. Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan650223,China; 3. State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,the Chinese Academy of Science,Beijing100101,China;)

In the present study, the differences between addictive memory and ordinary memory were investigated by morphine-induced and food-induced conditioned place preference (CPP) in adolescent and adult mice. The result showed that: 1) morphine-induced CPP could be established in adult mice but not in adolescent mice. 2) food-induced CPP could be established both in adolescent and adult mice. This study indicated that between adolescent and adult mice, there was no difference in ordinary memory, but for addictive memory, they were quite different. Our data suggested that the development of addictive memory and ordinary memory system in mouse brain might not be paralleled.

Adolescent; Adult; Morphine; Food; CPP

Q42; Q959.837; R338.1

A

0254-5853-(2011)05-0528-05

10.3724/SP.J.1141.2011.05528

2011-04-27；接受日期：2011-07-22

成瘾学习记忆与成瘾学习记忆有何不同？（30870825）

∗通讯作者(Corresponding authors)，E-mail: yuanma0716@vip.sina.com; xthu@mail.kiz.ac.cn