PTPIP51、p-Raf-1 及ERK1/2 在口腔鳞状细胞癌中的表达

肖玉霞， 邵乐南， 黄梅靖， 李 伟， Ishfa Hague

华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔颌面外科， 武汉 430030

口腔癌是世界范围内第6 大常见癌症，其中90%以上的口腔恶性肿瘤是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），口腔鳞状细胞癌具有较高的侵袭性和转移性，是导致患者死亡的主要原因。目前对于口腔鳞状细胞癌的发生、发展及侵袭与转移的具体机制尚不明确。

PTPIP51（protein tyrosine phosphatase interacting protein 51）是新近发现的一种进化保守蛋白，是序列相似性家族FAM 82 中成员，被命名为FAM82C。PTPIP51 在细胞内可通过不同的信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡和迁移的过程[1]。

Raf-1 是近年来研究较为广泛的一个癌基因表达产物， 是多种信号通路的枢纽。以往研究发现PTPIP51 在细胞中可能与Raf-1 蛋白结合并通过Ras/Raf/M EK/ERK 通路使细胞形态改变，并促进细胞迁移、运动，在恶性肿瘤中可能具有促进肿瘤侵袭及转移的作用[2]。ERK1/2 是通路下游蛋白，该蛋白活化能够磷酸化很多转录因子如Ets-1，c-Jun，c-Myc，p90Rsk及间接活化NF-κB 等转录因子。可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及调节血管生成等[3]。

本研究通过观察PTPIP51 蛋白与p-Raf-1 蛋白在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁正常口腔黏膜组织中的表达及细胞内定位，并检测PTPIP51 与E RK1/2基因mRNA 在口腔鳞状细胞癌与相应的癌旁正常口腔黏膜组织的表达情况， 分析PTPIP51 影响Ras/Raf/M EK/ERK 通路与口腔鳞状细胞癌发生发展以及侵袭、转移之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

经患者知情同意及医院伦理委员会通过，收集本院2009 年6 月～2010 年9 月手术切除的32 例口腔鳞状细胞癌组织和32 例相应的癌旁正常口腔黏膜组织（距肿瘤组织0.5 cm 以上，经苏木精-伊红染色确定）标本，所有患者术前均未经放疗或者化疗。所取病例标本经手术切除并进行标记后分两部分，一部分置于甲醛固定过夜后进行石蜡包埋、切片备用；另一部分立即置于液氮保存备用。全部病例术后均进行病理检查证实。其中，舌鳞状细胞癌10例，颊鳞状细胞癌10 例，唇癌5 例，牙龈癌5 例，口底癌1 例，腭鳞状细胞癌1 例；男性21 例，女性11例；年龄30 ～79 岁，发病年龄中位数56.3 岁。病理分级:高、中分化26 例，低分化6 例。按国际抗癌联盟（UICC）2002 年修订的唇及口腔癌TNM 分期，Ⅰ～Ⅱ期17 例， Ⅲ～Ⅳ期15 例。其中，有淋巴结转移13 例，无淋巴结转移19 例。

1.2 主要试剂及实验方法

1.2.1 双标荧光染色试剂、免疫组化试剂及实验方法 鼠抗人PTPIP51 多克隆抗体purified M axpab mouse polyclonal（B01P）（Abnova， USA）， 兔抗人p-Raf-1 多克隆抗体（Ser338/Tyr341）[4]-R、IgGFITC 荧光标记羊抗兔多克隆抗体，荧光标记羊抗鼠IgG-TRITC 多克隆抗体（Santa C ruz， USA），DAPI（上海奔大），SP 免疫组化试剂盒及DAB 显色试剂盒（武汉博士德）。

为观察2 种蛋白在同一细胞内的定位，采用免疫荧光双标记法激光共聚焦显微镜读片并摄片。免疫荧光双标记法实验简要步骤:将组织蜡块切成3～5 μm 厚的组织切片，脱蜡至水，蒸馏水及PBS 冲洗，微波进行抗原修复30 min，PBS 漂洗后滴加山羊血清封闭15 min， PBS 漂洗，按浓度1 ∶300 及1 ∶200将鼠抗人PTPIP51 多克隆抗体及兔抗人p-Raf-1 混匀并滴加于玻片标本， 4 ℃冰箱孵育过夜。第2 天取出，PBS 漂洗后滴加浓度均为1 ∶200 混匀的羊抗鼠多克隆抗体IgG-T RITC 及羊抗兔多克隆抗体IgG-FITC，其中T RITC 标记羊抗鼠多克隆抗体IgG 与鼠抗人PTPIP51 多克隆抗体特异性结合，发红色荧光；FITC 标记羊抗兔IgG 与兔抗人p-Raf-1 多克隆抗体特异性结合，发绿色荧光。室温孵育30 ～60 min，PBS 漂洗后滴加DAPI 室温孵育30 min。避光，30 min 内在激光共聚焦倒置显微镜下观察并摄片。所有细胞核显示蓝色荧光，阳性细胞显示红色或绿色荧光。为进一步观察阳性细胞的细胞类型及蛋白着色部位，对其阳性标本PBS 漂洗后进行常规苏木精-伊红染色，方法参照试剂盒说明书；同时取其连续切片进行PTPIP51 蛋白的免疫组化染色，鼠抗人PTPIP51 多克隆抗体的工作浓度为1 ∶300，方法参照SP 试剂盒说明书，DAB 显色后，苏木精复染，中性树胶封片，普通光学显微镜读片并摄片，阳性细胞是胞质或胞核内有棕黄色颗粒细胞。

1.2.2 Real-time PC R 实验试剂及实验方法 RN A 提取试剂T rizol（Invitrogen， USA），逆转录cDNA 试剂盒ReverT ra Ace-α-、实时荧光定量试剂盒SYBR Green Real-time PC R M aster M ix（TO YOBO，Japan）。PC R 所用引物委托TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司设计并合成，PTPIP51 引物序列上游5′-GGAGCTGCCAGATGTCACGA-3′， 下游5′-ATCAAGTCATGAAGGCCAGTGAAAC-3′， 扩增产物长度为108 bp；ERK1/2 引物序列上游5′-GCAAGCACTACCTGGATCAGCTC-3′， 下 游 5′-TCGGGCCTTCATGTTGATGATA -3′， 扩增产物长度95 bp；β-actin 引物序列上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，扩增片段长度为186 bp。

实验步骤:32 例口腔鳞状细胞癌及配对的癌旁正常口腔黏膜组织常规Trizol 提取总RNA，紫外分光光度计测量产物纯度及浓度。按逆转录试剂盒说明，吸取2 μL 总RNA 加入20 μL 反应体系中进行逆转录，其中5×PT Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL ，Oligo（dT）201 μL， RN ase inhibitor 1 μL， ReverTra Ace 1 μL ，Rnase free H2O 补足容量。用上一步的反应产物cDNA 为模板进行Real-time PCR 扩增，扩增体系为20 μL， 其中上、下游引物各8 pmol，ddH2 O 6.4 μL，SYBR Green M ix 10 μL，上一步反应产物2 μL 。反应分为3 个阶段，第1 阶段:95 ℃热启动30 s；第2 阶段:95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，进行40 个循环，在每个循环结束后收集荧光，作扩增曲线；第3 阶段:95 ℃30 s，55 ℃30 s，95 ℃30 s，在55 ～95 ℃每隔0.3 s 收集荧光，作熔解曲线，验证产物的特异性。并在1.5%琼脂糖凝胶电泳后紫外线灯观察并摄片。根据第2 阶段的CT 值通过ΔCT =C T目的基因-CT管家基因，计算目的基因相对管家基因表达强度， 2-ΔΔCT（ΔΔCT =ΔCT肿瘤组-ΔC T正常组）分别计算2 种基因在肿瘤组织的相对表达量[5]。当2-ΔΔCT＞1 时，目的基因的表达上调，反之表达下降。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 免疫荧光、免疫组化及病理学检查结果

免疫荧光显示PT PIP51 与p-Raf-1 蛋白均在口腔鳞状细胞癌的癌巢周边部位细胞及部分脉管壁内皮细胞中表达阳性（图1A ～C，图2A ～C），且2 种蛋白多为共定位表达（30/32），癌巢中央肿瘤细胞多数为阴性表达。正常黏膜阳性表达仅见于上皮下间质细胞内；癌旁正常口腔黏膜组织上皮基底层以上多数表达阴性，部分基底层细胞弱阳性（图3A ～C）。并附同一张病理切片的苏木精-伊红染色结果（图1D、2D、3D）。免疫组化进一步显示口腔鳞状细胞癌癌巢周围PTPIP51 阳性细胞为分裂活跃的肿瘤细胞，癌巢中央癌细胞多数为阴性表达（图4）；正常口腔黏膜组织上皮基底层可见部分细胞PTPIP51 蛋白阳性表达（图5）；所有组织均可见间质细胞PTPIP51 蛋白阳性表达。

2.2 Real-time PCR 结果

PTPIP51 及ERK1/2 基因mRNA real-time PCR 实验结果:32 例口腔鳞状细胞癌及对应的正常口腔黏膜组织均有PTPIP51 和ERK1/2 及内参βactin 基因mRNA 的扩增（图6），32 例肿瘤标本与相应正常黏膜标本PTPIP51 mRNA 相对表达量为（2.74±0.31）（P ＜0.05），ERK1/2 mRNA 相对表达量为:（5.14±0.64）（P ＜0.05）（图7），且2 种基因mRNA 的表达水平呈正相关（r =0.641， P ＜0.05）（图8）。数据显示肿瘤组的PTPIP51 及ERK1/2 mRNA 表达水平与患者性别、年龄、及病理分期无关（P ＜0.05）；与肿瘤TNM 分期及有无淋巴结转移有关，有淋巴结转移组2 种基因表达水平高于无转移组（P ＜0.05），见表1。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌是口腔颌面-头颈癌中常见的恶性肿瘤，统计数据显示近20 年来口腔癌的5 年生存率仅为50%～55%。肿瘤细胞向周围组织浸润和远处转移，是导致口腔癌患者死亡的主要原因[6]。恶性肿瘤的侵袭、转移是多基因及信号蛋白共同作用的结果，随着近代分子生物学的发展，发现恶性肿瘤侵袭和转移与细胞迁移运动能力改变、细胞凋亡失控、肿瘤内血管新生等有关。

PTPIP51 是一种进化保守蛋白，在正常人体多种组织及细胞等均有表达[7]，在胚胎及胎盘组织和多种肿瘤细胞也可检测到该蛋白的表达[8]。研究发现该蛋白与14-3-3 蛋白结合能够通过Raf-1 介导Ras/Raf/M EK/ERK 通路活化，促进细胞形态改变及细胞的迁移性、运动性增加[2]。本实验发现在正常人类口腔黏膜及口腔鳞状细胞癌中均有PTPIP51蛋白表达，并且在口腔鳞状细胞癌中可检测到PTPIP51 蛋白与p-Raf-1（Ser338/Tyr341）在细胞内多数共定位表达。

表1 PTPIP51及E RK1/2 基因mRNA 的表达与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系（±s）Table 1 Relationship betw een PTPIP51，ERK1/2 mRNA expression and clinicopathological features of OSCC（±s）

表1 PTPIP51及E RK1/2 基因mRNA 的表达与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系（±s）Table 1 Relationship betw een PTPIP51，ERK1/2 mRNA expression and clinicopathological features of OSCC（±s）

PTPIP51 m RNA ERK1/2 mRNA Clinicopathological featuresn Tumor group/Normal groupP Tum or group/No rm al groupP Age（years）0.5010.396≥50192.72±0.235.97±0.63 ＜50132.61±0.755.03±0.94 Gender0.6100.241 Male212.80±0.155.70±0.77 Female112.69±0.735.11±0.52 Differentiation0.0690.077 Well/Moderately262.48±0.364.79±0.81 Poo rly63.34±0.825.36±0.53 Lymph node metastasis0.0380.028 Positive133.11±0.586.21±0.16 Negative191.37±0.723.80±0.44 TNM stage0.0270.043 Ⅰ-Ⅱ172.29±0.523.11±0.83 Ⅲ-Ⅳ154.31±0.367.24±0.44

Mitogen-activated protein kinases（M APKs）家族在细胞中能够传导多种胞外信号到细胞核后通过转录因子调节基因表达，控制细胞的增殖、分化、凋亡、粘附及细胞迁移[9]。细胞外信号调节激酶（extracellullar signal-regulated kinase）ERK1/2 信号通路是MAPKs 家族中研究最为广泛的成员，研究发现Ras/Raf/M EK/ERK 通路在70%以上恶性肿瘤中广泛活化[10]。

恶性肿瘤中常发生Ras 基因突变，该基因活化可导致蛋白活化异常，活化的Ras 能够募集Raf 蛋白结合到细胞膜并使后者发生活化， Raf 家族中Raf-1 蛋白表达最为广泛，Raf-1 蛋白在细胞生存、细胞迁移及肿瘤形成方面具有重要作用已广泛证实[11-12]，目前已知Raf-1 有13 个位点可发生蛋白的磷酸化作用[13]，许多位点如S43，S259 和S621 位点磷酸化可导致蛋白失活，而S338，Y340 和Y341 位点磷酸化能够活化蛋白[14-15]。磷酸化p-Raf-1（Ser338/Tyr341）能够磷酸化并活化M EK1 蛋白并介导通路下游蛋白ERK1/2 活化[4]。而ERK 蛋白在调节细胞形态改变、细胞迁移、粘附及向周围间质扩展中发挥重要功能。并且证实ERK1/2 将活化信号传到细胞核后能够促进细胞增殖，抑制凋亡等。以往研究发现正常口腔黏膜组织不表达p-Raf-1 蛋白，而口腔鳞状细胞癌组织可见p-Raf-1 蛋白表达，本实验结果与之相符。本实验在证实PTPIP51 与p-Raf-1 在口腔鳞状细胞癌表达多数共定位表达的同时发现PTPIP51 与ERK1/2 mRNA 在肿瘤细胞高于癌旁正常黏膜组织，且二者表达具有相关性，统计学分析2 种蛋白的表达与肿瘤侵袭、转移相关。推断PTPIP51 与p-Raf-1 结合可能通过Ras/Raf/M EK/ERK 通路参与了口腔鳞状细胞癌的侵袭、转移。

另外一个参与肿瘤侵袭及转移有关的细胞信号过程是肿瘤细胞的上皮间质转型（epithelial-mesenchymal transition，EM T），表现为上皮细胞在与间质细胞相互作用中获得一些间质细胞特性，导致细胞形态间质化、迁移运动能力增加。在恶性肿瘤中表现为癌巢周围肿瘤细胞具有间质细胞特性细胞梭形改变，排列杂乱及肿瘤细胞的运动及侵袭性增加等，目前发现Ras/Raf/M EK/ERK 信号通路参与这一过程[16-17]。该实验显示癌巢周围癌细胞表现PTPIP51 及p-Raf-1 阳性，而这部分肿瘤细胞往往发生形态间质化及具有侵袭及转移能力，即发生肿瘤细胞的EM T ，提示2 种蛋白可能参与了肿瘤细胞的EM T 介导的细胞侵袭和转移。

S tenzinger 等[18]在对PT PIP51 蛋白表达的研究中发现PTPIP51 在正常皮肤上皮基底层以上表达阳性，同时发现该蛋白在皮肤上皮的表达受RA及1，25（OH）2D3和EGF 调节，而后者在正常皮肤上皮均具有促进细胞增殖及分化的重要作用，同时发现上调HaCaT 细胞中PTPIP51 蛋白的表达可检测到角蛋白10 及外皮蛋白的表达增加。推断PTPIP51 在皮肤上皮细胞中具有促进细胞增殖、分化的作用。本实验免疫组化染色显示在细胞增殖旺盛肿瘤细胞及正常黏膜基底层以上部分上皮细胞中检测到PTPIP51 蛋白阳性，同时免疫荧光染色显示PTPIP51 与p-Raf-1 蛋白在口腔鳞状细胞癌中表达共定位，结合real-time PCR 实验结果，推断该蛋白具有促进细胞增殖的功能。但是正常黏膜上皮基底层以上及鳞状细胞癌癌巢中央表达阴性与Stenzinger 等[1]、Koch 等[19]在皮肤上皮细胞及皮肤鳞状细胞癌的表述不同，推测新蛋白在正常口腔黏膜和皮肤表皮表达存在差异。

恶性肿瘤生长和转移的另一个条件是新生血管的充足血供，很多研究发现恶性肿瘤中新生血管密度增加与肿瘤细胞生长和转移密切相关。体内调节肿瘤血管生长的细胞因子主要有:碱性成纤维生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘样生长因子（PLGF）。Ras 和体内钙离子水平也能调节血管生成[20-21]。V EGF-A 在促进血管生成方面发挥最重要的作用，它和相应血管内皮生长因子受体结合后通过E RK 及PI3K 等途径能够调节内皮细胞增殖、细胞间的渗透性以及毛细血管新生。现已知PTPIP51 中的信号配体S rc 激酶活化能够促使VEGF 破坏VE-cadherin 在附着斑的定位，改变内皮细胞的渗透性。并且Raf-1 参与了对血管生成的调节及活化的ERK1/2 在调节内皮细胞渗透性过程发挥重要作用[1]。本实验发现口腔鳞状细胞癌中PTPIP51 及p-Raf-1 在血管周围部分免疫细胞及部分管壁表达阳性，提示PTPIP51 及p-Raf-1 可能在肿瘤侵袭、转移进程中参与肿瘤组织内的血管新生。

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