雪旺细胞与PDLLA/CS/CHS自组装复合材料生物相容性研究*

杨利剑, 梅玉峰, 徐海星

1武汉理工大学医院,武汉 430070

2湖北省鄂钢医院检验科,武汉 436000

3武汉理工大学生物材料与工程研究中心,武汉 430070

4武汉理工大学化工学院制药工程系,武汉 430070

周围神经的修复和再生的方法有自体神经移植、异体神经移植体和非神经移植体。但自体神经移植需要损伤健康的神经而出现供区感觉障碍、疤痕、断端、痛性神经瘤等,并且需要进行两次手术;而异体神经会对宿主的免疫原性产生排斥反应。因此许多学者利用天然的或人工合成的材料制备神经导管进行周围神经修复,常用的材料有聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PDLLA)、聚乳酸-己内酯共聚物[(PDLLA-CL)]、胶原、壳聚糖等[1-9]。

聚乳酸(PDLLA)是一种重要的生物可降解聚合物,以其优良的生物相容性和生物可吸收性以及良好的力学性能而被广泛研究和应用于周围神经损伤的修复中。PDLLA的最大优点是它在诸如体液的水性环境中能靠酯键的简单水解而进行降解,而且降解的最终产物能够被人体代谢生成二氧化碳和水而排出体外,这种代谢过程已被20多年前在豚鼠和大鼠中植入14C标记的PDLLA试样的实验结果所证实[10]。硫酸软骨素(CS)是细胞外基质的主要组成成分之一,是一种天然聚阴离子聚合物,能增强细胞黏附和识别能力,在体内具有一定的抗炎和代谢调节的功能[11]。壳聚糖(CHS)是一种天然多糖,生物相容性好,可生物降解,并能抑制成纤维细胞的生长,这一特性的意义是早期可以防止瘢痕组织长入再生神经中,晚期可避免瘢痕缩窄引起压迫,这一点对再生神经功能恢复、避免功能失常具有重要作用。具有良好可生物降解性的高分子PDLLA/CS/CHS复合材料在周围神经修复的研究中未见报道。

雪旺细胞(Schwann cells,SCs)是周围神经系统特有的胶质细胞,由 Theodor Schwann于1939年首先发现而命名,SCs是周围神经再生的种子细胞,已得到广泛的认同[12],不仅是其分泌生长因子,它分泌的细胞外基质成分也发挥着重要的作用。近年来,将有活力的种子细胞——SCs与不同材料复合培养,构建具有生物活性的神经桥接体逐渐成了研究的热点[13]。

本实验将武汉理工大学生物材料与工程研究中心培养的SCs与具有良好可生物降解性的高分子PDLLA/CS/CHS复合材料进行生物相容性研究,以期为PDLLA/CS/CHS复合材料进行周围神经修复奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

聚乳酸(PDLLA,重均分子量为 250 000)和SCs为武汉理工大学生物材料与工程研究中心自制和培养,壳聚糖(CHS,重均分子量为100 000,脱乙酰度为90%)购自浙江玉环海洋生物化学有限公司,硫酸软骨素(CS,Wt%＞99%),购自浙江嘉陵恒胜生物有限公司,所用试剂均为分析纯。扫描电镜(JSM-5610LV,JEOL,日本)。

1.2 SCs的培养与鉴定

行双30 min差速贴壁后的SCs细胞悬液,接种于已包被多聚 L-赖氨酸的25 cm2培养板中,于37℃、5%CO2、100%湿度培养过夜;48 h后换液,加入含10 μ mol/L阿糖胞苷培养液来抑制差速贴壁未除去的成纤维细胞生长;96 h后吸去所有培养液,并用培养液冲洗,加入含有成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养液,于 37℃、5%CO2、100%湿度培养,每隔48 h更换1次培养液,1周后计数总数,做生长曲线实验。在37℃、5%CO2条件下,培养3～5 d,行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。

1.3 材料的制备

1.3.1 CHS膜的制备 称取1 g壳聚糖(重均分子量为300 000)溶于50 mL 2%醋酸溶液中,过滤,置于玻璃模具中室温干燥,取膜至蒸馏水中充分漂洗,室温干燥即得。

1.3.2 PDLLA膜的制备 取1 g PDLLA溶于20 mL 1,4-二氧六环溶液中,置于玻璃模具中自然干燥,取膜至乙醇与水体积比为1∶1的溶液中去除油脂及杂质,然后用水充分漂洗,自然干燥即得。

1.3.3 PDLLA/CS/CHS复合材料的制备 ①芯材的制备:将PDLLA溶于1,4-二氧六环中,注入模具中,室温干燥至恒重,去模,转入真空烘箱干燥至恒重,浸入乙醇与水体积比为1∶1的溶液中去除油脂及杂质,然后用水充分漂洗,得 PDLLA支架芯材;②胺化反应:将步骤①得到的PDLLA支架芯材浸入己二胺异丙醇溶液中,进行胺解反应,用去离子水充分漂洗去掉未反应的己二胺,室温真空干燥箱中烘干至恒重;③酸化反应:将步骤②胺解的PDLLA管式多孔支架芯材于室温用0.02 mol/L盐酸酸化,用高纯水或三蒸水冲洗以去除吸附的盐酸;④材料组装:将酸化的PDLLA管式多孔支架芯材在CS溶液中浸泡,以吸附一层CS,并使表面带负电荷,用含0.5 mol/L NaCl的高纯水或三蒸水冲洗,去除多余CS;然后将其浸入到含CHS的乙酸溶液中浸泡,使其表面吸附一层带正电荷的CHS,先用质量浓度为0.6%的乙酸溶液冲洗,再用含NaCl为0.2 mol/L的高纯水或三蒸水冲洗,以除多余的CHS;重复上述步骤5～8次,制备出多层结构的管式多孔支架复合物;⑤将步骤④得到的管式多孔支架复合物浸入液氮迅速深度冷冻,真空冷冻干燥,即得自组装支架材料。

1.4 SCs与PDLLA/CS/CHS复合材料生物相容性评价

1.4.1 MT T实验 ①将壳聚糖(CHS)、聚乳酸(PDLLA)及PDLLA/CS/CHS复合材料剪成96孔培养板孔洞的大小,用75%乙醇和紫外灯消毒上述材料。其具体方法是:将材料浸泡于75%乙醇2 h,用无菌PBS洗3次,每次5 min,然后于紫外灯下干燥,分别放于 96孔培养板中的 1、2、3排,3～7孔中。即CHS第1排5个孔,PDLLA第2排5个孔,PDLLA/CHS/CS第3排5个孔。

②将分离纯化好的SCs细胞悬液(冷酶联合消化法得到),用DMEM/F12+10%FBS培养液配成5×104/mL单细胞悬液,将细胞接种于96孔培养板中 1、2、3 排的 2～ 6 孔中 ,每孔 200 μ L,即每孔细胞数为104个,1、7、8孔加无细胞的培养液,1、8孔提供湿环境,2孔为SCs对照,7孔为材料空白对照。将培养板置CO2孵箱中,在 37℃、5%CO2条件下 ,分别培养 0 、2、4 、7、10 d 。

③培养相应时间后,取一培养板,每孔加入MTT溶液(将MT T按5 mg/mL溶于0.01 mol/L,pH 7.2的PBS中,轻轻吹打至全部溶解,过滤除菌,4℃避光保存,保存时间一般不超过2周)20 μ L,继续置培养箱孵育3～6 h,终止培养,加10%SDSHCl 100 μ L/孔37℃数小时,将细胞内和细胞周围的MTT-甲穳颗粒充分溶解。

④用酶联免疫检测仪在波长490 nm测定各孔吸光度值(A),记录结果,求平均值。3种材料及SCs对照组间进行比较。

1.4.2 环境扫描电镜观察 PDLLA/CS/CHS复合材料剪成12孔培养板孔洞的大小,用75%乙醇和紫外灯消毒材料,置于12孔培养板中。材料上放上无菌48孔大小的玻璃培养圈,接种密度为106/mL的已纯化的 SCs 500 μ L(冷酶联合消化法得到)。将培养板置CO2孵箱中,在37℃、5%CO2条件下,培养7 d。用戊二醛固定后,环境扫描电镜观察材料上细胞的生长情况。

2 结果

2.1 细胞生长曲线

用MTT实验测得的SCs生长曲线如图1(图上数据为统计后的结果),SCs生长曲线近似“S”形,平台期约为1 d左右,对数期为5～7 d,倍增时间约为5 d左右。

2.2 苏木精-伊红染色

图1 SCs生长曲线Fig.1 The growth curve of Schwann cells

由图2可见,SCs细胞核为蓝色较大,卵圆形,约为整个细胞的1/3到1/2,胞质为红色,有双极细胞突起,细胞体部直径约为10 μ m;部分细胞突起有三极,突起细长,一般为体部直径的1～5倍,并交织成网状,胞体为梭形或三角形,细胞成栅栏状排列。而成纤维细胞为扁平状,形状不规则,突起不明显。

图2 SCs苏木精-伊红染色图片Fig.2 Hematoxy lin-eosin dying of Schwann cells

2.3 免疫组织化学染色

2.3.1 辣根过氧化物酶标记的抗S-100细胞免疫组化染色 由图3可见细胞形态与倒置显微镜下观察到的活体细胞形态是一致的,细胞边界清楚,梭形细胞的两端有突起,胞质深染,胞核染色较淡,细胞胞体和突起呈棕褐色,苏木精衬染可见胞核较大为圆形或椭圆形,而成纤维细胞未着色,呈透明状。细胞计数(500个)得到阳性细胞占细胞总数的(91.3±1.5)%,即SCs的纯度超过90%[14]。

图3 辣根过氧化物酶标记的抗S-100细胞免疫组化染色Fig.3 Immunohistochemical staining of anti-S-100 cells labeled with

2.3.2 异硫氰酸(FITC)荧光标记的抗NGFRp75细胞免疫组化染色 由图4可见SCs有黄绿色荧光,而成纤维细胞没有荧光,细胞阳性率与辣根过氧化物酶标记的抗S-100细胞免疫组化染色差异无统计学意义。

图4 异硫氰酸(FITC)荧光标记细胞免疫组化染色(×200)Fig.4 Immunohistochemical staining of cells labeled with FITC(×200)

2.4 MTT实验

图5为几种材料的MT T实验结果。从图中可知:①随着培养时间的延长,PDLLA组、CHS组和PDLLA/CS/CHS复合材料组的A值逐渐增加;②在0、2、4 d,3组的 A值均低于SCs对照组;③在7 d和10 d时,PDLLA、CHS组的 A值亦低于SCs对照组,但PDLLA/CS/CHS复合材料组的A值却高于SCs对照组,差异无统计学意义(P＞0.05),但PDLLA/CS/CHS组与PDLLA组差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明,PDLLA/CS/CHS复合材料具有较好的细胞相容性,并且具有一定的促进SCs增殖的能力。

图5 各组M T T实验结果Fig.5 M TT assay results of several groups

2.5 环境扫描电镜观察

环境扫描电镜观察SCs接种于PDLLA/CS/CHS复合材料上培养7 d后结果显示,SCs贴附于PDLLA/CS/CHS复合材料的表面,SCs成双极或三级突起,双极细胞一般长50～80 μ m,SCs的突起相互交织,部分细胞向PDLLA/CS/CHS复合材料的膜的孔隙生长。见图6。

图6 环扫电镜观察SCs在PDLLA/CS/CHS复合材料上生长的情况Fig.6 Growth of Schwann cells on the PDLLA/CS/CHS composite materials under the environmental scanning electron microscopy

3 讨论

3.1 SCs的培养鉴定

SCs鉴定主要通过形态学及免疫学方法来进行。SCs是少数几种通过形态学特征即可与其它细胞区别的细胞之一。原代培养大鼠SCs形态学特征表现为:体积小、梭形、多为双极;核为圆形,细胞突起长50～100 μ m。在相差显微镜下,细胞常有一发亮的边缘。成纤维细胞则以体积大、扁平、核淡染、细胞轮廓不清和无突起等特点易与SCs区别[14]。

SCs的免疫学鉴定是根据SCs和成纤维细胞所含抗原成分不同来制备特异性的抗体,利用抗原-抗体结合反应来区别SCs和成纤维细胞。大鼠SCs表现为NGFRp75和S-100蛋白阳性,成纤维细胞表现为 Thy-1和纤维连结素阳性[15]。通过 S-100蛋白免疫组化鉴定,细胞计数(500个)得到阳性细胞占细胞总数的(91.3±1.5)%,即SCs的纯度超过90%。达到了组织工程应用的要求。本实验将形态学方法和免疫学方法结合应用,保证了结果的可靠性。

3.2 评价人工神经支架材料的方法

支架材料上SCs的成活状态及生物活性是移植体成功与否的关键。评价人工神经支架材料的方法有MTT法、环境扫描电镜观察等[16]。本研究将MTT法用于PDLLA/CS/CHS复合材料培养的SCs活性检测,发现静电自组装PDLLA/CS/CHS生物材料培养的SCs A值接近于正常培养,且明显高于 PDLLA 组(P＜0.05)。提示 PDLLA/CS/CHS复合材料上培养的SCs增殖力较强、数量较多,PDLLA/CS/CHS复合材料上较适于SCs黏附、增殖。环境扫描电镜可以在形态上直观地反映细胞在支架材料二维、甚至三维的生长情况以及形态特征。通过环扫电镜观察PDLLA/CS/CHS复合材料上SCs的形态,增殖状况,发现在 PDLLA/CS/CHS复合材料上SCs生长较好,增殖速度也较快,其结果与MT T实验有一致性,由此可见PDLLA/CS/CHS复合材料是生物相容性较理想的生物材料,有良好的材料-细胞界面,较利于SCs黏附及生长、增殖。

用于神经导管的材料有很多,由于生物降解神经导管在神经再生过程中被人体逐步降解吸收,不需二次手术取出,避免了神经导管对再生神经轴突的慢性卡压等特性,使生物降解材料神经导管越来越受到人们的重视。本实验采用PDLLA、CS、CHS为基材通过静电自组装技术制备的 PDLLA/CS/CHS复合材料用来作为修复神经的人工导管,是因为PDLLA是一种可生物降解的高分子聚合物,CHS是一种生物大分子,均具有良好的生物相容性和生物降解性能,而且PDLLA、CHS均有学者用于作为修复神经的导管材料[17-20],通过MTT实验和环境扫描电镜观察SCs在PDLLA、CHS表面的生长情况,证实了PDLLA 、CHS、CS对SCs的生长无抑制、毒害作用,可以在其表面良好生长,具有良好的生物相容性。但是由于CHS机械性能较差,脆性较大,作为神经导管机械性能还不能满足要求,而PDLLA机械性能较好,但降解性能不能达到与神经生长匹配的要求。本实验利用静电自组装技术将PDLLA、CHS复合起来,既克服了CHS脆性大的弱点又克服了PDLLA降解慢的弱点,此外还添加了CS,CS是细胞外基质成分之一,而细胞外基质有利于轴突的再生和 SCs的增殖[21],因而 PDLLA/CS/CHS复合材料具有更好的生物相容性和亲和性,有利于周围神经的再生和修复。

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