条斑紫菜蛋白酶解物降血压活性

姚兴存，蒋栋磊，盘赛昆，舒留泉

(淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏连云港，222005)

条斑紫菜蛋白酶解物降血压活性

姚兴存，蒋栋磊，盘赛昆，舒留泉

(淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏连云港，222005)

研究了以条斑紫菜为原料，采用木瓜蛋白酶制备紫菜蛋白活性寡肽，以ACE抑制率为评价指标，研究不同水解条件下酶解液的降血压活性，优化酶解工艺条件并测定酶解物的分子量。优化后的木瓜蛋白酶酶解工艺条件为pH7.5，温度50℃，底物浓度30 mg/mL，酶添加量600 U/g，在此条件下，水解4 h的酶解产物抑制活性达30%以上，ACE抑制肽的半抑制浓度IC50值为4.48 mg/mL。将制备的酶解液进行层析分析，测得具有降血压活性的紫菜蛋白酶解产物是相对分子质量小于2 000的活性肽。

条斑紫菜，ACE抑制活性，木瓜蛋白酶

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)为海洋食用藻类，大量人工养殖于长江以北的江苏沿海，主要成分为碳水化合物和约30%的蛋白质［1］，此外还含有维生素、矿物质及生物活性物质等，对预防高血压、冠心病等有较好功效［2］。近年来，紫菜的深加工研究取得了一定进展，利用复合酶水解得到的水解混合物，已证明具有降血脂、防止动脉粥样硬化的功能［3］。王茵等［4］研究了坛紫菜的6种蛋白酶水解物的降血压活性，优化了AS1398中性蛋白酶的酶解工艺;何荣海等［5－7］研究了超声波辅助酶提取、酶与膜分离耦合、混合酶法等制备紫菜降压肽的方法及条件。本研究以连云港产条斑紫菜为原料，使用作用条件温和、对植物蛋白质有较好水解效果的木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白质，研究紫菜蛋白酶解物的降血压活性及其分子量分布，为开发新一代海洋功能性食品，提升紫菜深加工的技术水平提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

条斑紫菜为2010年3月连云港西墅物产有限公司生产的紫菜干品。50℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，100目过筛后超临界CO2流体萃取除去脂肪，储于广口瓶中干燥保存。

血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)、辅酶 I(NAD)、短杆菌肽(Bacit racin zinc)、蓝色葡聚糖2000(Dextran blue 2000)等购于美国Sigma公司;Sephadex G-15为Pharmacia公司产品;木瓜蛋白酶(酶活力为30 000 U/g)、乙酸乙酯等购于上海生工有限公司;马尿酸、酪氨酸等购于国药集团化学试剂有限公司;其它试剂皆为国产分析纯。

1.2 主要仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;Duo Flow层析系统，美国Bio-Rad公司;Primo R多用途台式高速冷冻离心机，美国热电公司;PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;FW-100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;KS-300超声波粉碎机，宁波科生仪器厂;RE-501旋转蒸发仪，南京金正科教仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制备

精确称取一定量紫菜干粉放入烧杯中，加100 mL水混合均匀，超声辅助提取15 min，倒入离心杯中4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL。将提取液倒入三角瓶中，调节pH，加入木瓜蛋白酶，充分均匀后于50～60℃水浴中酶解，每间隔20 min振荡1次，4h后取出，100℃灭酶10 min，自然冷却后8 000 r/min离心15 min，收集上清液冷藏备用。

1.3.2 酶解物降血压活性测定

体外降血压活性用血管紧张素转换酶(ACE)的抑制率来表示，抑制活性的测定采用紫外比色法［8］并对部分试剂用量进行适当调整。在反应试管内，依次加入75μL 8.3 mmol/L HHL底物液、25μL抑制剂(酶解液)混合均匀，(37±0.5)℃恒温水浴预热3－5 min，然后加入10 μL 0.05 U/mL ACE液充分混合，在(37±0.5)℃水浴中反应1 h，反应结束后立即加入150 μL 1 mol/L HC1以终止反应(空白组需提前加入HC1)。然后于各试管中加入1.7 mL乙酸乙酯，旋涡混合后4 000 r/min离心10 min;吸取1.4 mL乙酸乙酯层移于另1支小试管中，放入80℃烘箱中挥发溶剂3h，取出冷却后加入超纯水3 mL(50～60℃水浴预热)，旋涡混合30 s后在228 nm下测定吸光度，计算公式如下:

式中:Ab:样品b的吸光度，样品b在反应中不加抑制剂，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应的对照;Aa:样品a的吸光度，样品a在反应中加抑制剂，是ACE与HHL同时反应的样品;Ac:样品c的吸光度，样品c在反应前先失活ACE，再加抑制剂，是ACE与HHL反应的空白。

1.3.3 酶解物相对分子质量分布测定

采用凝胶层析法测定［9－10］，由 SephadexG-15 柱(φ1 cm×49.6 cm)分析检测。以5 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)为洗脱液，流速为0.4 mL/min，上样量为2 mL，QuadTecTM检测器检测，检测波长280 nm。标准样分别为L-酪氨酸(Mr=181.19)，AMP(Mr=347.2)，辅酶 I(NAD，Mr=681.44)，短杆菌肽(Mr=1486.2)，用缓冲液配成5mg/mL的溶液备用，用蓝色葡聚糖2000测定柱外水体积Vo，然后由标准样的保留时间计算出相应的洗脱体积Ve，以相对分子质量的对数值(logMr)为横坐标，Kav［即(Ve－Vo)/(Vt－Vo)］为纵坐标绘制标准曲线。样品的相对分子质量根据其洗脱体积由标准曲线求得。

2 结果与分析

2.1 酶解工艺条件的优化

为进一步确定木瓜蛋白酶水解紫菜制备降血压肽的最优工艺条件，在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验，研究因素间的交互作用。每组正交试验重复处理3次，结果取平均值，应用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理。试验因素和水平设计见表1，正交试验结果见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果方差分析

由表2的极差分析和表3的方差分析可以看出，每个因素对抑制率的影响是不同的，因素对木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白的影响主次顺序是A＞C＞D＞B，即pH和酶解温度对紫菜蛋白的水解度影响极其显著，其次是底物浓度，加酶量的影响不显著。由此，确定各因素的最优水平组合为A3B3C1D3，即最佳水解条件为:酶解pH值7.5，酶添加量为600 U/g，温度为50℃，底物浓度为30 mg/mL。在此条件下，进行3次验证试验，测得紫菜蛋白酶解液ACE抑制率平均值为34.2%，说明最佳工艺条件的酶解物具有最大抑制率。

2.2 酶解液降血压活性的量效关系

在优化的酶解条件下，即酶解pH值7.5，加酶量600 U/g，温度为50℃，底物浓度为30 mg/mL制备酶解液。将制备的酶解液浓缩5倍后，分别稀释至原液的5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5 倍，得到 10 组浓度不同的酶解液，分别进行ACE抑制活性测定试验，结果如图1所示。

图1 不同浓度酶解液的ACE抑制率

由图1可见，紫菜木瓜蛋白酶解液随着样品浓度的升高，ACE抑制率明显增加，且抑制率与剂量(浓度)之间存在良好的对数回归关系，由方程计算木瓜蛋白酶酶解的紫菜蛋白水解产物对ACE的半抑制浓度IC50值为4.48 mg/mL，表明紫菜木瓜蛋白酶解液具有较强的降血压活性。

2.3 酶解物相对分子质量分布的测定

试验测得SephadexG-15柱的Vo为17.95 mL，Vt为38.96 mL，由各标准物的保留时间计算出相应的Ve，进而计算出有效分配系数Kav，制作标准曲线如图2，图3为木瓜蛋白酶紫菜蛋白酶解产物的层析色谱图。

图2 用SephadexG-15凝胶层析测定分子量标准曲线图

图3 木瓜蛋白酶解液层析色谱图

图3 显示，具有较高ACE抑制活性的紫菜蛋白产物活性峰主要分布在保留时间为60.91 min处，其次为保留时间121.92 min和45.55 min处。通过将以上3峰的保留时间计算后代入图2的标准曲线，计算得出第1峰的相对分子质量为1 995，第2峰的相对分子质量为1 259，第3峰的相对分子质量为170。因此，具有降血压效果的紫菜蛋白酶解产物主要是相对分子量小于2 000的活性肽。

3 结论

以木瓜蛋白酶水解条斑紫菜制备具有生物活性的小分子肽，其ACE抑制肽的IC50为4.48 mg/mL;将最佳酶解条件下制备的酶解液进行层析分析得到具有降血压效果的紫菜蛋白酶解产物的相对分子质量分布在2 000以下;以ACE抑制率为评价指标，通过正交试验进一步优化了酶解条件，木瓜蛋白酶制备紫菜降血压肽的最佳工艺条件是pH7.5，温度50℃，底物浓度30 mg/mL，酶用量600 U/g，水解时间4 h。

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［3］ 钱伟靖，胡文斌，施庆忠，等.条斑紫菜提取液的降血脂作用及其临床观察［J］.中国海洋药物，1998，(2):43－45.

［4］ 王茵，刘淑集，吴成业.紫菜降血压肽酶法制备工艺的优化［J］.福建水产，2008(4):64－68.

［5］ 何荣海，马海乐，周存山，等.超声波在酶法生产紫菜降血压肽过程中的应用［J］.江苏大学学报:自然科学版，2007，28(1):4 －7.

［6］ 李文，马海乐，王金斌.酶解反应与膜分离耦合连续制备紫菜降血压肽［J］.食品科技，2008(10):71－75.

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［9］ 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术［M］.北京:高等教育出版社，1981:124－132.

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Study on Antihypertensive Activity of Bioactive Oligopeptide from Porphyra yezoensis Proteins

Yao Xing-cun，Jiang Dong-lei，Pan Sai-kun，Shu Liu-quan
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)

In the paper，the preparation of bioactive oligopeptides from Porphyra yezoensis proteins in the presence of papain was studied.The ACE inhibitory activity was used as response to optimize the enzymatic conditions.The molecular weight distribution of the hydrolysates was determined by gel filtration chromatography on SephadexG-15 column.The result of which showed that the optimum conditions were pH 7.5，temperature 50℃，substrate concentration 30mg/mL，addition amount of enzyme 600 U/g.Under such conditions，and hydrolyzing for 4 hours，the inhibitory activity of the hydrolysates reached up to 30%，with IC50 value reaching 4.48mg/mL.The hydrolysates of Porphyra yezoensis were then determined by chromatography，the result of which showed that the hydrolysates of antihypertensive activity from Porphyra yezoensis proteins was mainly oligopeptide with molecular weight less than 2000.Key words Porphyra yezoensis，ACE inhibitory activity，Papain

硕士，副教授。

*江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2008HS015)

2010－07－28，改回日期:2010－11－12