不同干条斑紫菜和烤条斑紫菜光合色素含量分析

侍江春，肖宇雪，俸贵强，蔡甜，陈科伟*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(食品科学与工程国家级实验教学示范中心(西南大学)，重庆，400715)3(西南大学 化学化工学院，重庆，400715)

紫菜隶属于红藻门、原红藻纲、红毛菜目、红毛菜科、紫菜属藻类，条斑紫菜(Pyropiayezoensis)和坛紫菜(Pyropiahaitnensis)是主要的养殖种类[1]。紫菜是东亚(中国、日本、韩国)主要经济海藻之一[2-3]，中国是主要的紫菜生产国，其中江苏省为条斑紫菜主要生产区[1, 4-5]。紫菜富含蛋白质、多糖、纤维素、矿物质和维生素等多种营养成分和生物活性物质[6-8]，含有25%～50%(质量分数，干重)的蛋白质和25%～40%的碳水化合物[2, 9]。市售干条斑紫菜是一种高蛋白、低脂肪、富含膳食纤维和多种矿物质的天然食品[10]，干条斑紫菜经烤制即为烤条斑紫菜或海苔，深受消费者喜爱[11]。

色泽是评价条斑紫菜商业价值的重要指标。条斑紫菜中含有丰富的光合色素，主要包括藻胆蛋白和叶绿素[12]。藻胆蛋白是一种高效捕光色素蛋白，由脱辅基蛋白和几种藻胆素特异性结合而成，存在于蓝藻、隐藻、红藻及少数甲藻中[13]。根据波长吸收性质不同可分为藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和别藻蓝蛋白[14-15]。藻胆蛋白具有抗氧化性、抗炎和抗癌能力[16]，作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、纺织品等领域，作为功能因子应用于保健品、药品、抗氧化剂和抗炎药物试剂，因较强的荧光特性和较宽的吸收光谱作为荧光探针和光敏剂应用于生物医学领域[10, 16-18]，具有较高的生物利用价值。

叶绿素为镁卟啉化合物[19]，普遍存在于高等绿色植物、原核的蓝藻菌和真核的藻类中[20-22]，具有抗菌、消炎、护肝、防臭、抗氧化、抗诱变等功能[21-22]，尤其在功能性食品、医药、化妆品方面有良好的开发前景。

目前尚未有文献报道建立干条斑紫菜和烤条斑紫菜颜色与仪器分析相关联的质量评价体系，我国对干条斑紫菜分级参照GB/T 23597—2009标准执行，紫菜的色泽指标仅凭肉眼观测。为此本研究通过实验分析紫菜中的藻胆蛋白和叶绿素的含量和组成，用色差仪客观量化干条斑紫菜和烤条斑紫菜外观颜色，并与光合色素含量进行相关性分析和逐步回归分析，建立色泽指标同光合色素间的量效关系，以期为商业紫菜产品的质量评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

不同等级干条斑紫菜(AAA、A、B、C、D、E级)，万紫汇紫菜交易平台，所有紫菜均为江苏省连云港生产，紫菜分级严格按照万紫汇专业平台定级。烤条斑紫菜以AAA级干条斑紫菜为原料，分别在180 ℃烤制30～50 s，参考js/zcxh 001—2014《条斑紫菜 干紫菜等级标准》定级为1～5级。液氮，重庆沙坪坝区双流液氮经营部；N,N-二甲基甲酰胺(N,N’-dimethylformamide, DMF)、MgCO3、醋酸铵、NaH2PO4和Na2HPO4(均为分析纯)、甲醇和丙酮(均为色谱纯)，重庆市钛新化工有限公司；叶绿素a标准品，日本wako试剂公司；叶绿素a衍生物标准品，实验室自制[23]。

1.2 主要仪器及设备

UltraScan PRO分光测色仪，美国Hunter Lab公司；Depelec TE55ACS嵌入式蒸烤一体机，德普凯信(浙江)有限公司；SPEX SamplePrep Geno高通量冷冻研磨机，上海德可纳利仪器有限公司；SQP电子天平，赛多利斯(北京)科学仪器有限公司；KQ3200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；磁力搅拌器，上海齐欣科学仪器有限公司；Centrifuge 5810离心机，艾本德(上海)国际贸易有限公司进口；UV-1240紫外分光光度计、LC-20A高效液相色谱仪(含二极管阵列检测器)，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

不同等级干条斑紫菜和烤条斑紫菜在液氮保护下，用高通量冷冻研磨机研磨成粉，过80目筛，-23 ℃密封保藏备用。

1.3.2 颜色测定

采用色差仪对过80目筛的不同等级干条斑紫菜、烤条斑紫菜进行颜色测定，得到客观量化颜色指标值L*、a*、b*、c*、h*，其中L*为明亮度，L*值越大，明度越大，感觉越白；a*为红绿色度，正值为红方向，负值为绿方向；b*为黄蓝色度，正值为黄方向，负值为蓝方向；c*和h*分别为色泽饱和度和色调角，分别按公式(1)(2)计算：

(1)

(2)

1.3.3 光合色素含量测定

1.3.3.1 藻胆蛋白含量测定

藻胆蛋白的提取：参考文献[24]的方法，准确称取200 mg条斑紫菜粉于50 mL离心管中，加入40 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.5)，700 W超声处理5 min后，4 ℃磁力搅拌提取2 h，5 000 r/min离心5 min，取上清液测量。

藻胆蛋白含量的测定：吸取样品上清液，分别测定其在562、615、652 nm波长处的吸光值。藻胆蛋白含量按公式(3)(4)(5)计算：

(3)

(4)

(5)

式中：ρ(P)，藻蓝蛋白的含量，mg/mL；ρ(AP)，别藻蓝蛋白的含量，mg/mL；ρ(PE)，指藻红蛋白的含量，mg/mL。

1.3.3.2 叶绿素含量测定

叶绿素的提取和测定采用高效液相色谱进行分析[25-26]。DMF用过滤后饱和MgCO3溶液配成90% DMF水溶液，用于提取条斑紫菜中叶绿素。准确称取200 mg条斑紫菜粉于50 mL离心管中，加入40 mL提取液，700 W超声处理5 min后，4 ℃提取过夜，0.22 μm过滤后即可用于高效液相色谱分析。

采用梯度洗脱程序,流动相A∶V(甲醇)∶V(1 mol/L醋酸铵溶液)∶V(水)=8∶1∶1；流动相B∶V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1。流速为1 mL/min，流动相B起始体积分数25%，35 min内，流动相B 线性变化至100%，并保持15 min。采用二极管阵列检测器检测(350～700 nm)，根据标准品和色谱峰吸光性质定性定量分析叶绿素a及其衍生物。

1.3.4 数据分析

条斑紫菜颜色测定重复20次，结果表示为平均值±标准差。其余试验均重复3次，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0进行显著性差异分析、Pearson相关分析、逐步回归方程分析(不同字母表示P<0.05的显著性差异)，Origin 8.1软件制图。

2 结果与分析

2.1 条斑紫菜颜色分析

由图1可知，不同级别干条斑紫菜和烤条斑紫菜组间组内L*、a*、b*、c*、h*值差异显著(P<0.05)。各颜色指标值差异最大的是a*值和h*值，干条斑紫菜为正值，烤条斑紫菜为负值，表明干条斑紫菜偏红而烤条斑紫菜偏绿。烤条斑紫菜相比于干条斑紫菜L*、b*值更大，表明烤条斑紫菜比干条斑紫菜更白、更黄。黄林彬等[27]研究发现，高温可导致条斑紫菜叶状体颜色不同程度加深，说明烤制对条斑紫菜的外观颜色产生一定影响，使烤条斑紫菜相较于干条斑紫菜呈现明亮的黄绿色。不同级别干条斑紫菜和烤条斑紫菜L*、a*、b*、c*值均呈现“波动状”，ARUGA[28]发现，紫菜品质的好坏主要取决于叶状体的3种主要光合色素(绿色的叶绿素a、蓝色的藻蓝蛋白和红色的藻红蛋白)含量的高低，且与它们之间的比例相关，所以无法用单一色度值表征干条斑紫菜和烤条斑紫菜等级。

a-不同种类条斑紫菜L*值对比图;b-不同种类条斑紫菜a*值对比图;c-不同种类条斑紫菜b*值对比图;d-不同种类条斑紫菜c*值对比图;e-不同种类条斑紫菜h*对比图图1 条斑紫菜各颜色指标值Fig.1 Color indexes of Porphyra yezoensis

2.2 光合色素含量分析

叶绿素和藻胆蛋白色素是条斑紫菜中主要的光合色素[12]。由表1可知，干条斑紫菜光合色素含量大小依次为藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素a，烤条斑紫菜光合色素含量大小依次为藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白和叶绿素a。不同级别干条斑紫菜别藻蓝蛋白含量差异不显著，变异系数最低为14.97%。其余各光合色素含量和总藻胆蛋白含量、总叶绿素、总光合色素含量差异极显著(P<0.01)，变异系数均在15%以上。藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a分别为16 202.78～30 706.41、18 370.28～30 528.13和1 330.64～2 846.16 mg/kg。经过烤制以后，烤条斑紫菜中藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、叶绿素 a、脱植基叶绿素a、总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量均减少，其藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素 a含量为干条斑紫菜的1/5～1/6。高温操作影响光合色素的稳定性，俞丽燕[29]、CHAIKLAHAN等[30]研究发现，藻蓝蛋白的稳定性易受温度、pH、光照强度、离子浓度等的影响，高温也能造成叶绿素 a的降解，使其含量降低[31]。另外程超等[32]在研究葛仙米藻胆蛋白与色度降解动力学时发现，葛仙米藻蓝蛋白色素溶液在高温处理时会有明显的褪色现象，并且温度越高褪色越明显。经过烤制后，紫菜中大量藻胆蛋白分解，叶绿素比例增加，从而显现出绿色或黄绿色[33]，与图1结果相一致。烤条斑紫菜中，叶绿素衍生物含量明显增多，如C132-OH 叶绿素a、脱镁叶绿素a、焦脱镁叶绿素a、phytyl-purpurin a，表明叶绿素在期间也发生了脱镁和氧化反应。烤条斑紫菜各光合色素含量变异系数均在20%以上，脱植基叶绿素a、叶绿素a甚至达到50%以上，说明经过烤制之后，会增大条斑紫菜之间光合色素含量的差异。

2.3 条斑紫菜颜色与光合色素含量的相关分析

对6种干条斑紫菜和5种烤条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标进行相关分析，然后进一步对干条斑紫菜和烤条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标进行逐步回归分析。

2.3.1 干条斑紫菜各光合色素含量之间的相关分析

干条斑紫菜各光合色素含量间相关性结果见表2。光合色素含量中总光合色素含量与其他光合色素含量均呈正相关，与藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、脱植基叶绿素a、叶绿素 a、总藻胆蛋白、总叶绿素含量显著正相关(r=0.604～1.000)，与C132-OH 叶绿素a、脱镁叶绿素a、焦脱镁叶绿素a含量正相关，但相关性不显著(r=0.196～0.202)；总藻胆蛋白与藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、脱植基叶绿素a、叶绿素 a含量显著正相关(r=0.551～0.995)；总叶绿素与藻蓝蛋白、藻红蛋白、脱植基叶绿素a、叶绿素 a含量极显著正相关(r=0.718～1.000)；C132-OH 叶绿素a、脱镁叶绿素a、焦脱镁叶绿素a含量之间极显著正相关(r=0.805～1.000)。总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量与藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a之间相关性极强，均在0.900以上(P<0.01)，可见各光合色素含量之间都存在着不同程度的相关性。

2.3.2 烤条斑紫菜各光合色素含量之间的相关分析

烤条斑紫菜各光合色素含量间相关性结果见表3。总光合色素含量与藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、脱植基叶绿素a、叶绿素a、总藻胆蛋白、总叶绿素含量显著正相关(r=0.651～0.994)，与C132-OH 叶绿素a、脱镁叶绿素a、phytyl-purpurin a含量呈负相关，其中与phytyl-purpurin a含量相关性最强，相关系数为-0.773(P<0.01)。藻蓝蛋白、藻红蛋白与脱植基叶绿素a、叶绿素 a、总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量均呈正相关,与干条斑紫菜相比，相关系数均下降，而别藻蓝蛋白与其相关系数却上升，可能由于烤制之后烤条斑紫菜藻蓝蛋白和藻红蛋白含量成倍地减少，而别藻蓝蛋白只减少至干条斑紫菜的一半，从而导致相关系数上升。尽管如此，除了藻红蛋白与总叶绿素相关性不强外(r=0.273)，烤条斑紫菜总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量和藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素 a含量极显著相关(r=0.602～0.962)，说明藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a依然是烤条斑紫菜3种重要的光合色素。

2.3.3 条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标的相关分析

条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标相关性结果见表4。烤条斑紫菜phytyl-purpurin a含量与b*、c*值显著正相关(r=0.914，0.906)，说明b*、c*值越大，烤条斑紫菜phytyl-purpurin a含量越多。其余条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标值相关性不显著(P<0.05)。但可看出干条斑紫菜a*值与各光合色素含量呈负相关(r=-0.493～-0.185)，c*值和h*值与各光合色素含量呈正相关(r=0.062～0.390，r=0.033～0.714)，表明a*值越小、c*值和h*值越大，干条斑紫菜各光合色素含量越多。干条斑紫菜总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量与L*、a*值呈负相关，与b*、c*值和h*值呈正相关，而烤条斑紫菜总藻胆蛋白、总叶绿素、总光合色素含量与L*、a*、b*和c*值呈负相关，与h*值呈正相关，可能因为烤制之后烤条斑紫菜呈黄绿色，藻蓝蛋白含量成倍减少，使其与b*值的相关性增强。综合分析，干条斑紫菜和烤条斑紫菜L*、a*值越小，h*值越大，总藻胆蛋白、总叶绿素和总光合色素含量越多。

表2 不同级别干条斑紫菜光合色素含量之间的相关性Table 2 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of dried laver

表3 不同级别烤条斑紫菜光合色素含量之间的相关性Table 3 Correlation of photosynthetic pigment content in different grades of roasted laver

表4 色度值与光合色素含量之间的相关性Table 4 Correlation between chroma value and photosynthetic pigment content

2.3.4 条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标的回归分析

根据干条斑紫菜、烤条斑紫菜各光合色素含量与其颜色指标的相关性分析可知，各光合色素含量与颜色指标值存在一定的关系。为了进一步了解各光合色素含量与颜色指标值间的关系，以各光合色素含量为因变量(Y)，颜色指标值为自变量(X)，进行逐步多元线性回归分析。

如表5所示，通过逐步回归分析后，模型中各光合色素含量预测值与实际值的相关系数与表4中每种光合色素含量与颜色指标值单独的相关系数相比，均有不同程度的提高。这说明经逐步回归分析舍去相关性差的指标后，可提高光合色素含量预测模型的准确性。单自变量的预测模型没有提高相关系数。干条斑紫菜别藻蓝蛋白含量预测值与实际值的相关系数较低，可能因为别藻蓝蛋白仅与单一颜色指标存在相关性且相关系数较低。

表5 条斑紫菜各光合色素含量与颜色指标回归分析Table 5 Regression analysis of photosynthetic pigment content and color index of P.yezoensis

干条斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的预测焦脱镁叶绿素a含量(Y8)，其回归方程如表5所示，所建立的模型在99.9%的程度上，可以通过L*值和h*值反映干条斑紫菜中焦脱镁叶绿素a含量。烤条斑紫菜L*(X1)、a*(X2)和b*值(X3)可以很好的预测藻蓝蛋白(Y1)和总藻胆蛋白含量(Y10)，所建立的模型对其解释概率都为100%，拟合程度非常完美。烤条斑紫菜L*值(X1)和h*值(X5)可以很好的预测别藻蓝蛋白含量(Y3)，b*(X3)、c*(X4)、h*值(X5)可以很好的预测phytyl-purpurin a含量(Y9)，所建立的模型对其解释概率分别为95%和100%(P<0.05)。由上可知，干条斑紫菜的焦脱镁叶绿素a含量和烤条斑紫菜藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、phytyl-purpurin a、总藻胆蛋白含量可以通过颜色值反映，而总光合色素以及条斑紫菜中3种主要的光合色素(藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a)与颜色值建立的模型没有显著意义。为了进一步探究总光合色素含量和藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a含量间的关系，以总光合色素含量为因变量(y)，藻蓝蛋白(x1)、藻红蛋白(x2)、叶绿素a含量(x3)为自变量，进行逐步多元回归分析。干条斑紫菜总光合色素含量y1=10 445.04+1.96x1(R2=0.992，P=0.000)，烤条斑紫菜总光合色素含量y2=1 429.94+2.5x1(R2=0.971，P=0.002)，说明干条斑紫菜和烤条斑紫菜藻蓝蛋白含量可以很好地预测总光合色素含量，为快速估计条斑紫菜中总光合色素含量提供参考。

3 结论

条斑紫菜色泽是紫菜光合色素含量和品质优劣的“指示剂”，且条斑紫菜光合色素在人体内具有重要的保健功能[34]。本文通过对6种干条斑紫菜和5种烤条斑紫菜进行光合色素含量及颜色测定，通过干条斑紫菜和烤条斑紫菜光合色素含量与颜色指标的相关性分析，可以得出以下结论：干条斑紫菜光合色素含量大小依次为藻蓝蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素a，烤条斑紫菜光合色素含量大小依次为藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白和叶绿素 a。经过烤制之后的藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a含量为干条斑紫菜的1/5～1/6。干条斑紫菜和烤条斑紫菜各光合色素含量之间均有不同程度的相关性(|r|=0.037～1.000，|r|=0.041～0.994)，光合色素含量与颜色指标存在相关性，但相关性不强(|r|=0.033～0.994，|r|=0.034～0.914)。进一步以逐步回归分析建立各光合色素含量的预测模型可提高光合色素含量预测值与实际值间的相关性，从而提高颜色指标反映条斑紫菜品质的准确性。但颜色指标对预测干条斑紫菜焦脱镁叶绿素a含量、烤条斑紫菜藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、phytyl-purpurin a和总藻胆蛋白含量较为显著，对总光合色素含量及3种主要的光合色素含量不显著。为此建立干条斑紫菜和烤条斑紫菜总光合色素含量与藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素 a含量的逐步多元回归方程，结果表明藻蓝蛋白含量可以很好的预测条斑紫菜总光合色素含量。