响应面法优化超声波辅助提取红曲米中水溶性色素＊

嵇 豪， 蒋冬花， 杨 叶， 周 琴， 王长春

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

食用色素是食品工业、制药工业和日化工业不可缺少的一类添加剂，按其来源可分为天然色素和合成色素2种．近年来，由于安全问题，部分合成色素被限制使用，因此开发利用无毒的天然色素日益受到人们的重视［1］．利用食品安全级微生物合成天然色素是一种比较理想的途径．红曲色素是红曲霉(monascus spp．)生长过程中产生的次级代谢产物．红曲霉固体发酵制取红曲米，是当前红曲色素的主要生产方式［2］．我国于1985年制定了红曲米作为食品添加剂的国家标准．产业化生产红曲色素主要采用60%～80%的乙醇溶液对红曲米浸提，提取液经蒸发浓缩，再经真空干燥或喷雾干燥，即生产出商品化的红曲色素粉［3］．这种红曲色素粉色素成分较杂，主要为水不溶性的红斑素和红曲红素等，因此很大程度制约了其应用场合．水溶性红曲色素则具有食用方便、无酒精异味等优点，因此，开发水溶性红曲色素具有一定的现实意义．

近年来，超声波法在生物技术和食品加工领域受到了广泛的关注，利用超声波产生的强大能量加速细胞壁的破裂和物料中有效成分的转移、扩散，从而达到提取的目的［4］．目前，有关超声波辅助提取植物中有效成分的报道较多［5-7］，但利用超声波辅助提取红曲米中的水溶性红曲色素未见报道．本实验以去离子水为提取溶剂，超声波辅助提取红曲米中的水溶性色素，并采用响应面法对色素提取的最佳工艺进行了优化，旨在为直接提取红曲米中水溶性色素提供一个可行的工艺方法．

1 材料与方法

1．1 实验材料

红曲米为本实验室保藏的红曲霉菌株Mp-41经固体发酵制得．

1．2 主要仪器和设备

MIKRO 22R高速冷冻离心机(德国Hettich公司);UV-7504紫外可见分光光度计(上海欣茂有限公司);JY92-ⅡN超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技有限公司);RO型反渗透纯水仪(美国Kflow公司)．

1．3 水溶性红曲色素的测定

水溶性红曲色素的测定采用分光光度法．将红曲米研磨后，加入适量的去离子水，经超声波辅助提取及冷冻离心后，适当稀释，测定其紫外可见光吸收光谱．

1．4 单因素实验

选择超声时间、液料比(V(去离子水)∶m(红曲米))和超声功率3个因素，分别考察了各因素对水溶性红曲色素提取的影响，以确定各相关因素的作用范围．

1．5 响应面优化实验

综合单因素实验的结果，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理［8］，对超声时间、液料比和超声功率3个因素进行响应面设计，确定最优的提取工艺．各实验组的编码及取值见表1，共15个实验点，其中12个为析因点，3个为零点．

表1 实验因素水平及编码

1．6 数据处理

实验用设计分析软件为Design Expert 6．0．

2 结果与分析

2．1 水溶性红曲色素的紫外可见光吸收光谱

将红曲米粉的超声波水提取液在300～600 nm进行紫外可见光谱扫描．结果(见图1)表明，该水溶性色素在黄色特征吸收波长范围内的370 nm处有明显的最大吸收，而在480 nm，象征红色素的特征峰不明显，且吸收值较小．因而整个色素提取液呈现黄色调．本实验采用370 nm作为水溶性红曲色素的检测波长，与Yongsmith等［9］获得的红曲霉突变株所产黄色素吸收峰一致．

图1 水溶性红曲色素的紫外可见光吸收光谱

2．2 超声波辅助提取水溶性红曲色素的单因素实验

2．2．1 超声时间

在液料比为20∶1，超声功率为400 W的条件下，考察了不同的超声波作用时间对水溶性红曲色素提取液色价的影响．由图2可以看出:在作用时间为5～20 min时，随着超声时间的延长，提取液的色价呈直线上升趋势;当超声时间达到20 min时，色价达到一个较高的水平;之后，随着提取时间的延长，色价变化不明显．这可能是由于随着超声时间的延长，溶剂体系的渗透压达到平衡，水溶性红曲色素无法继续随着溶剂向细胞外扩散，从而表现为提取液的色价保持稳定．综上，本着提高色价和缩短提取时间的目的，将水溶性红曲色素提取的最适超声时间确定为20 min．

图2 超声时间对水溶性红曲色素提取液色价的影响

2．2．2 液料比

在超声时间为20 min，超声功率为400 W的条件下，考察了不同的液料比对水溶性红曲色素提取液色价的影响．由图3可以看出:随着溶剂体积的增大，提取液的色价在初期有明显的提高;当液料比达到30∶1时，色价达到较高的水平;之后，随着液料比的增大，色价反而有所降低．这可能是由于溶剂体积的增加使红曲米颗粒与溶剂的接触界面增大，从而提高了传质的效率;当液料比继续增大时，由于溶剂的增加，超声波作用产生的能量被分散，搅拌不够充分，反而造成了提取效果的下降．因此，对液料比的较佳取值为30∶1．

图3 液料比对水溶性红曲色素提取液色价的影响

2．2．3 超声功率对红曲色素提取的影响

在超声时间为20 min，液料比为30∶1的条件下，考察了不同的超声波功率对水溶性红曲色素提取液色价的影响．由图4可以看出:随着超声功率的增大，提取液的色价呈现上升的趋势;当超声功率为700 W时，色价达到一个较高的水平;之后，继续提高超声功率，色价反而有所下降．这可能是由于超声功率过高，超声波对红曲米的组织结构产生了破坏作用，体系中有微小的淀粉颗粒析出并吸附了部分色素分子，这一部分色素在冷冻离心过程中被沉淀，从而造成提取液的色价降低［10］．值得注意的是，当超声功率升高到900 W时，提取液中有油状物，影响了色价的测定，这可能是由于超声功率过高造成了红曲米中油脂析出．另外，过于强烈的机械振动也可能使色素的构象发生改变，造成了提取液色价的下降．

图4 超声功率对水溶性红曲色素提取液色价的影响

2．3 响应面优化实验

2．3．1 响应面优化实验结果分析

利用软件 Design Expert 6．0的 Box-Behnken中心组合设计，对超声时间、液料比和超声功率设计响应面实验，其结果见表2．通过Design Expert 6．0软件对表2数据进行了回归分析，拟合后得到超声时间(A)、液料比(B)和超声功率(C)的二次多项式回归模型

对上述回归模型进行了方差分析，结果(见表3)表明该回归模型极显著(P=0．000 3＜0．01)．回归模型的决定系数 R2=0．988 3，校正决定系数R2Adj=0．967 2，失拟项 P=0．172 9 ＞0．05，不显著，说明该回归模型与实验数据拟合程度较高，实验误差小，可以用该模型分析和预测超声波辅助提取水溶性红曲色素的工艺结果．回归模型中的一次项均显著，二次项均为极显著，交互项AB和BC显著，表明各影响因素对提取液色价的影响并不是简单的线性关系．3个因素中对提取结果影响最大的为液料比，其次为超声功率，影响程度最小的为超声时间．

表2 响应面优化实验设计方案及结果

表3 回归模型的方差分析数据

图5 超声时间与液料比对水溶性红曲色素提取液色价影响的响应面和等高线

图6 超声时间与超声功率对水溶性红曲色素提取液色价影响的响应面和等高线

图7 液料比与超声功率对水溶性红曲色素提取液色价影响的响应面和等高线

2．3．2 超声波辅助提取条件分析与优化

多元回归方程的响应面及其等高线见图5～图7，通过这组动态图即可对任何两因素之间交互影响的效应进行分析和评价，并从中确定最佳的因素水平范围．响应面是响应值对各实验因素所构成的三维空间曲面图，因素对实验结果影响越大，表现为曲面越陡峭．等高线的形状则可以反映两两因素之间交互作用的显著程度．圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反．

由图5～图7的等高线可以直观地看出，超声时间与液料比、超声功率与液料比对提取液的色价有着显著的交互作用，而超声时间和超声功率对提取液色价的交互作用不太显著，各因素与水溶性红曲色素提取液色价的关系均可清晰地看出．根据Box-Behnken实验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design Expert 6．0软件获得了提取液色价最高时的最佳超声波辅助提取条件:超声时间为20．63 min，液料比为32．15 ∶1，超声功率为726．73 W．在此优化条件下，水溶性红曲色素提取液的色价理论值为571．769 U/g．考虑到实际操作的情况，在超声时间为20．6 min，液料比为32 ∶1，超声功率为730 W的条件下，进行了5次重复验证实验．5 次实验的提取液色价分别为571．5，568．8，572．7，565．5，574．0 U/g，验证实验提取液色价的均值为570．5 U/g，与理论预测值误差仅为0．2%．说明采用响应面法得到的工艺参数较为可信，利用超声波辅助方法提取红曲米中水溶性色素具有一定的可行性与应用价值．

3 结论

红曲米中包含多种色素成分，工业上对红曲米中红曲色素的提取溶剂采用70%乙醇，提取液中成分复杂，大部分为亲水性差的醇溶性色素，这在一定程度上限制了红曲色素的推广使用．本实验利用超声波产生的脉冲作用，以水为溶剂，对红曲米中的水溶性色素进行了提取，提取残渣还可采用常规方法二次提取醇溶性色素．本实验结果显示，该方法提取的水溶性红曲色素在370 nm处有明显的吸收峰，具有黄色素特征．通过单因素实验和响应面法优化超声波辅助提取红曲米中的水溶性色素，得到一个二次多项式回归模型(R2=0．988 3)，模型拟合度良好．回归模型的方差分析结果表明，各因素对超声波辅助提取色素的影响大小依次为:液料比＞超声功率＞超声时间．最终确定的超声波辅助提取红曲米中水溶性色素的最佳工艺条件为:超声时间20．6 min，液料比32 ∶1，超声功率730 W．经过实验验证，该优化条件下水溶性红曲色素提取液的色价为570．5 U/g．利用超声波辅助提取法可以有效地分离提取红曲米中的水溶性色素，最终获得的色素色价较高，且具有提取时间短的特点，避免了光敏性红曲色素因长时间暴露在外而造成的损失［11］．

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