菌根真菌对有机氮吸收利用的研究进展*

马继芳， 金海如

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

菌根真菌是一类与植物形成菌根的真菌．所谓“菌根”，即真菌菌丝与植物根细胞在地下紧密相连，菌丝一端延伸到土壤中，使宿主与土壤的接触面积变大了［1-2］;菌丝另一端伸入到宿主根皮层细胞间，宿主细胞(碳水化合物释放)与真菌细胞(P和N释放)之间所有矿质养分的交换都被认为发生在真菌-植物交界面上［3］．土壤中的有机氮只有一小部分被植物直接吸收，大部分或可能被微生物利用或可能被土壤基质固定［4］．菌根真菌纤细菌丝容易穿入有机物正在分解的微域或与其他微生物直接竞争分解产物［5］，并将氮转运给植物．此外，菌根真菌还能将从土壤的其他各种有机氮中获得的氮向宿主植物转移，从而增强了植物获氮能力，并且拓宽了植物获氮种类．

自1952年Melin等［6］首次证明了根外菌丝体吸收氮源并运转给宿主植物后，学者们对菌根真菌从土壤中吸收利用各种氮源的能力做了大量的研究工作．目前主要以七大菌根中的丛枝菌根真菌、外生菌根真菌和欧石南科菌根真菌为研究材料．丛枝菌根真菌可与80%以上的陆生植物共生，包括绝大多数的农作物，而外生菌根真菌和欧石南科菌根真菌主要与灌木、乔木共生［7］．对这3种菌根真菌利用有机氮的研究，近年来从生理和分子2个方面取得了一些成果:菌根真菌不但能从无机氮、氨基酸、肽、有机残体等中吸收利用氮素并能转运给宿主，而且从菌根真菌中已克隆出一些与有机氮代谢相关的基因．本文综述了现有的文献资料，为进一步研究菌根真菌对有机氮的吸收利用寻找切入点．

1 菌根真菌对有机氮吸收利用的生理学方面的研究

1．1 菌根真菌对氨基酸、肽和蛋白质的吸收利用

植物-真菌共生体对有机氮的利用因其避开了氮的矿化途径而引起重视［1］．

植物菌根比非菌根吸收利用有机氮的能力强，非菌根化的植物利用有机氮的能力极弱．Smith等［8］研究了欧石楠科菌根真菌-欧石楠共生体、外生菌根-垂枝桦树在不同有机氮源的条件下幼苗长势、体内积累的氮量，发现非菌根化的宿主植物利用单一氨基酸、寡肽的能力受到限制．Plassard等［9］向海岸松施加谷氨酸或者向玫瑰桉、柠檬桉施加各种氨基酸，尽管这2种桉树都能以谷氨酸作为氮源，但与菌根化后相比利用能力仍低得多．Bajwa等［10］向非菌根化的大果越桔、Finlay等［11］向小干松加杂合底物牛血清蛋白、麦醇溶蛋白，结果均表明:至少这几种植物非菌根化时利用有机氮的能力是相当弱的．Abuzinadah等以有机氮作为外生菌根真菌的氮源，发现不同外生菌根真菌能吸收利用不同形式的有机态氮，并且存在很大的差异性，有的真菌能在蛋白质及多肽上生长，而有一些则生长较弱［12］．欧石楠科菌根真菌除了能利用一些可溶性的小分子有机氮源，甚至能利用一些难溶性的大分子有机氮化合物［5］．

菌根真菌本身即为有机氮氮库．对许多外生菌根真菌［13-14］、欧石楠菌根真菌 Hymenoscyphus ericae及其大量变异种［15-16］的研究，都得出氨基酸是菌根真菌生长的重要氮源．

菌根真菌能将其库存的氮转移给宿主植物．文献［1］研究显示，与小麦共生的丛枝菌根真菌Glomus mossae的根外菌丝有摄取转运甘氨酸、谷氨酸的功能．此外，从枝菌根的根外菌丝对不同形态氮素吸收并向宿主植物转运的速率因种类而异:在以玉米为宿主，以G．mossae和G．intraradices为接种剂的实验中，植株收获前48 h向菌丝室添 加15N-NH4+，15N-NO3－，15N-尿 素，15N-甘 胺 酸(Gly)，15N-谷氨酰胺(Gln)和15N-谷氨酸(Glu)等，测定宿主植物嫩枝和根中的15N．结果表明，丛枝菌根根外菌丝向宿主植物吸收传递15N的能力因菌种种类和添加到菌丝室的氮素种类而异，吸收NH4+和尿素比其他15N氮源如NO3－和氨基酸快［17-20］．丛枝菌根真菌吸收 NH4+的速率最大，这是因为:NH4+以主动运输被直接吸收同化进入氮中心代谢途径;NO3－被主动吸收进胞内后必须先还原为NH4+才能被同化，所以需要消耗更多的能量;氨基酸则必须通过输运蛋白输送至胞内后才能被利用．吸收方式的不同导致它们的吸收速率也不同．如图1所示，丛枝菌根真菌吸收同化N主要通过硝酸盐还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS/GOGAT)途径，并通过尿素循环将吸收的 N 整合入 Arg［21-22］．文献［21-23］利用丛枝菌根真菌G．intraradices与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根(Ri T-DNA transformed carrotroots)建立的双重离体培养系统并结合同位素标记法，证明了在根外菌丝中合成的Arg能在根外菌丝与根内菌丝间进行双向运转(见图1)．文献［24-25］认为Arg可能与多聚磷酸盐(Poly P)通过螯合作用在根外和根内菌丝间一起运转．另外，丛枝菌根真菌具有无隔多核结构，其液泡可能在根内菌丝和根外菌丝间变形为管状，或通过原生质变形而形成管状液泡脉冲，这样Arg便能在此管状液泡中顺浓度梯度从根外菌丝向根内菌丝移动［26］．根内菌丝的精氨酸经尿素循环中的精氨酸酶分解为鸟氨酸(Orn)和尿素，尿素经尿酶分解并释放NH+4，释放的NH+4作为氮源可以整合入菌根内的其他氨基酸或通过NH+4转运蛋白转运给宿主植物细胞，用于合成植物氨基酸、蛋白质、核苷酸等(见图1)．

图1 丛枝菌根真菌对外源氮的吸收、运转、分解、代谢及传递途径的模型［21-22］

综上所述，人们已经弄清楚丛枝菌根真菌对可溶性小分子有机N(氨基酸)的吸收代谢途径，也证明了外生菌根真菌和欧石楠科菌根真菌能够通过分泌蛋白酶利用肽、蛋白质并向宿主转移氮，但丛枝菌根真菌肽、蛋白质的吸收代谢途径却有待进一步的研究．此外，菌根真菌-宿主交界面上的N释放机制目前也存在争议［1］．

1．2 菌根真菌对大分子复合物有机氮的吸收利用

在大多数类型的土壤中，氮主要以难溶的高分子含氮化合物形式存在［27］．因为在自然生态系统中共生体对有机氮的利用形式是以吸收可溶性的有机氮源为主的，所以这些难溶的高分子有机氮化合物只有通过酶分解变成可溶性的小分子化合物才能被宿主植物、菌根及菌根真菌菌丝吸收利用［28］．

外生菌根真菌和欧石楠科菌根真菌能分泌胞外蛋白酶，从而利用大分子有机氮源．蛋白酶分解蛋白质是有机氮分解的第一步．文献［29］证明了欧石楠科菌根真菌H．ericae分泌的胞外酸性蛋白酶可以利用大分子含氮化合物获得氮．在外生菌根真菌中也测量到胞外蛋白酶的活动性．蛋白质水解后，脱氨酶脱去氨基酸的氨基，向环境释放NH4+．文献［1］报道，外生菌根真菌生长在无葡萄糖培养基上时会向其所在的培养基释放NH4+．

丛枝菌根真菌能否像外生菌根真菌和欧石楠科菌根真菌那样分泌胞外酶尚未获得直接的证据，有待今后的研究．目前，研究仅证明了丛枝菌根真菌能促进有机体分解并从中获得氮源．Hodge等［20］运用网隔分室系统，向真菌室加经15N/13C双重标记并研磨后的黑麦草叶，研究发现植物体内有15N积累，而且丛枝菌根真菌(G．hoi)菌丝提高了植物从培养系统中的获氮量，获氮量与蔓延至有机物中的菌丝密度呈线性相关．Nayyar等［30］分别利用明球囊霉(G．Clarum)、近球囊霉(G．claroideum)和根内球囊霉(G．intraradices)作为侵染俄国野生黑麦(Psathy rostachys junce)的菌种，发现3种真菌的接种处理使植物吸收氮量较不接种处理平均提高了28%．Leigh等［31］通过向菌丝室加经15N，13C标记的碎骨对比了G．hoi和 G．intraradices两种真菌从真菌室中的有机质向宿主植物转运氮的能力，验证了Hodge等所得的结论，此外还发现转运的氮量占植物总氮量的20%，且G．intraradices比G．hoi转运氮的能力更强．这表明菌根真菌不但能利用植物性有机氮，也能利用动物性有机氮．

Hodge等的研究并没有发现13C随15N一起转移给宿主植物根系，说明从枝菌根真菌只将大分子有机氮中的氮素转移给植物．丛枝菌根真菌是以何种方式吸收利用大分子有机氮的，是以无机氮的形式还是以有机氮的某种形式直接吸收?这一问题尚不清楚．一些研究表明丛枝菌根真菌参与了有机氮的降解:1)通过根外菌丝能刺入土壤颗粒中并分泌一些水解酶加速植物组织的降解，如纤维素酶、果胶酶、木葡聚糖酶等［30-31］直接参与有机氮的降解;2)通过改变土壤根际微生物群落的结构间接加速有机氮的降解，因为菌根真菌菌丝能提高碳从宿主细胞到土壤系统的分配，而碳的供给能极大地提高丛枝菌根室中多能性微生物的活动性，其中多能性微生物或许参与了养分的降解与释放［32］．而相反的理论基础如Chapin等［33］最近提出了生态系统(土壤亚系统)中氮循环的改进模式:其驱动力和控制环节不再是由微生物完成的矿化作用，而是由胞外酶催化的含氮聚合物(蛋白质等)的解聚这一过程释放的氨基酸、氨基糖、核酸等单体物质供微生物和植物利用．据此，丛枝菌根真菌又极有可能分泌胞外蛋白酶对大分子有机氮降解(这在外生菌根真菌和欧石楠科菌根真菌中得到证实)．因为以上所有研究都不是在无菌条件下进行的，所以，根据现有研究资料尚不能判断丛枝菌根真菌对大分子有机氮的代谢方式．

总之，关于菌根真菌对难溶高分子含氮化合物吸收利用的完整而又清晰的代谢途径尚处于探究阶段．此外，农田原位评估菌根共生体利用难溶高分子含氮化合物对植物氮营养的贡献率也值得重视．

2 菌根真菌对有机氮吸收利用的分子水平的研究

近十年来，除了积累共生体吸收同化有机氮生理学方面的数据外，也致力于分子水平的研究，如基因克隆，从而加深了菌根真菌对有机氮吸收同化方式的了解．从外生菌根已克隆出与有机氮吸收代谢相关的几个基因(见表1)．相比之下，对内生菌根中的丛枝菌根真菌或其他15N菌根真菌的研究尚属空白，但今后有望从丛枝菌根真菌中克隆出与有机氮代谢相关的基因．

Amanita muscaria(Am)，Hebeloma cylindrosporum(Hc)和Tuber borchii(Tb)是主要用来进行分子学研究的外生菌根真菌．

氨基酸、肽转运载体:AmAAP1是对碱性氨基酸亲和力高，对中性、酸性氨基酸亲和力稍微有点低的酸性氨基酸转运载体［34］．HcGAP1是一种普遍的氨基酸转运载体［35］;HcPTR2A和 HcPTR2B是2种肽的转运载体［36］;HcOPTI是一种寡肽的转运载体［37］(见表1)．

与硝酸盐吸收同化相关的基因:Nrt2是Hebeloma cylindrosporum和Tuber borchii两种真菌至今仅有的一个NO3－高亲和力的转运载体．Tb/Hc-Nar1，Tb/HcNir1是从Tb，Hc中克隆出来的编码硝酸盐还原酶(EC 1．6．6．3)的基因、亚硝酸还原酶(EC 1．6．6．4)的基因［38-39］(见表 1)．

与NH4+吸收相关的基因:AMT是编码NH4+转运载体的基因，HcAMT1，HcAMT2和HcAMT3是从Hebeloma cylindrosporum中克隆出的NH4+转运载体，HcAMT1和HcAMT2是编码NH4+高亲和力的转运载体的基因，而HcAMT3则是编码对NH4+高亲和力的转运载体的基因［40］;TbAMT1是从Tuber borchii克隆出的编码NH4+运转载体的基因，并且它只有在 N缺乏时才被激活表达［41］;AmAMT2从 Amanita muscaria中克隆出来的对NH4+高亲和力的转运载体的基因［42］;GintAMT1是最新从菌根真菌G．intraradices克隆出的AMT家族的成员，编码对NH4+高亲和力的转运载体的基因［43］(见表 1)．

表1 菌根真菌中克隆出的或者检测到表达的与氮吸收代谢相关的基因

3 菌根真菌吸收利用有机氮实验装置的研究

以从枝菌根真菌为例．丛枝菌根真菌是一种专性寄生真菌，目前仍不能进行单独培养，必须与植物一起培养．现今所用的实验装置基本上仍是在一个容器中，用尼龙网将一个菌根室与一个或多个菌丝室分隔开［44-47］，或者用聚四氟乙烯薄膜(PTFE)(防渗透)［48-49］，该装置通常都是用来种植整株植物．此外，丛枝菌根真菌G．intraradices与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根(Ri TDNA transformed carrotroots)建立的离体双重培养系统(两室有盖培养皿培养装置)，也被用来研究丛枝菌根真菌菌丝体氮的运输［19］．

目前，研究的主要难题是如何控制氮在菌丝室和菌根室之间的大量流动．控制室间氮大量流动可通过以下3条途径:1)造成长期缺N条件，即在尼龙网旁边用空气层隔开［44-47］;2)用聚四氟乙烯薄膜，它能使15N的被动运输减少86%［48-50］;3)用两室有隔培养皿［21］．显然，两室有隔培养皿是最好的装置，因为它不但能够严格控制添加的营养液在菌丝室和菌根室间流动，而且还能示踪营养从菌丝体到根的全过程．但两室培养体系也存在局限性，即它不能承载嫩枝．

4 展望

土壤中含有丰富的有机氮源(占土壤总氮量的85%以上［4］)，种类繁多的天然菌根真菌资源为开发天然生物肥料提供了充足的条件．利用菌根真菌实现粮食增产，符合低碳减排绿色环保循环经济的理念，因此，研究菌根真菌对有机氮吸收利用的意义深远．

目前，在生理学和分子学方面人们已经获得了一些菌根真菌对有机氮营养吸收利用的研究结果，但仍有许多问题待解决，尤其是:含氮化合物在宿主植物根-菌根真菌交界处交换机制是怎样的?交换机制又是如何被控制的?现有2种研究方法:1)尽力完成基因测序和注释;2)联合标记试验与差异组织分析．建立氮交换图谱似乎很重要，途径图谱包括不同氮源、不同浓度，如果能够判断出关键的代谢产物——它的浓度决定菌根共生体转移氮到宿主细胞的效率，那样再拓宽了解其他的真菌，而非近年来已研究的少数几种，将会有助于更好地掌握农田菌根共生体的生态功能［1］．

以上是针对实验室条件下菌根真菌利用有机氮的独立研究，可以了解单独的菌根真菌的有机氮代谢途径．要想达到菌肥大规模的实际生产应用，结合现有的研究进展及需要克服的问题，还需从以下几个方面进行研究:

1)菌根真菌利用有机氮较优的生理生化条件及其生态系统中其他氮的影响;

2)菌根真菌对有机氮的代谢过程与氮矿化的关系;

3)菌根真菌活动性与土壤有机氮动态变化的关系;

4)土壤生态系统中原位评估菌根真菌吸收利用有机氮对植物氮营养的贡献率，追踪有机氮对植物生长的长期效应．

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