TAT-N24穿膜融合多肽对前列腺癌细胞增殖的影响*

邓豫，王桂华，左学良，董硕，金源，李维娜，龚建平，胡俊波

(华中科技大学同济医学院附属同济医院1.肿瘤研究所/胃肠外科;2.感染性疾病研究所，武汉 430030)

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)是连接胞外细胞生长信号与信号通路的重要蛋白，参与了细胞增殖、凋亡、分化及糖代谢等重要作用［1］。研究表明，PI3K的活性与多种人类肿瘤的发生发展密切相关［2-4］。2003 年，XIA 等［5］发现:PI3K调节亚基p55PIK氨基端(N末端)的24个氨基酸(N24)能够结合细胞周期调节蛋白Rb，并使后者磷酸化，进而调控细胞周期进程。胡俊波等［6-11］在体外和体内实验中证实:高表达N24能够抑制胃癌、肝癌和结肠癌等细胞的生长。为了高效安全地将N24应用于肿瘤治疗，胡俊波等合成并纯化了TAT-N24穿膜融合多肽(简称TAT-N24)，研究证实其能有效抑制结肠癌等的生长［12-14］，这为针对PI3K信号通路的分子靶向治疗开辟了新的手段。前列腺癌(prostate carcinoma，PC)是较常见的男性恶性肿瘤，且发病率逐年上升［15］，40 a来发病率增加了近5倍［16］。前列腺癌的治疗以手术为主，辅以内分泌治疗等，预后较差。近年来分子靶向治疗在肿瘤治疗领域进展迅速，笔者在本研究将初步探讨TAT-N24对前列腺癌PC3细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 前列腺癌PC3细胞株由本实验室常规培养，高糖达尔伯克改良必需基本培养基(dulbecco＇smodified minimal essentialmedium，DMEM)及胎牛血清购于Hyclone公司，鼠抗人BrdU单抗购于Santa Cruz公司，异硫氰酸荧光素(fluorescein isthiocyanate，FITC)荧光标记的IgG购于丹麦Dako公司，流式细胞仪FACSort由美国Becton Dickson公司生产。

1.2 细胞培养和处理 PC3细胞用含10%小牛血清和双抗(青霉素100 U·mL-1及链霉素 100μg·mL-1)的DMEM培养液培养，置于37℃、5%二氧化碳培养箱，待细胞生长至融汇度为60%～70%时分为TAT-N24多肽组，对照多肽组(终浓度均为100μg·mL-1)和无干预对照组(空白组)，24 h后收取细胞进行相应检测。

1.3 BrdU/PI双掺法测定细胞DNA合成 PC3细胞接受相应干预24 h后，加入BrdU，终浓度为10μmol·L-1，30min后用0.25%胰酶消化收集细胞，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗1次后用75%冰乙醇固定，-20℃保存过夜。取固定后细胞PBS洗1次，PBS-T［含 0.1% 苯磺酸(benzenesulfonic acid，BSA)，0.2%聚山梨酯20］洗1次，2 mol·L-1盐酸作用45 min，以0.1 mol·L-1四氢硼砂(pH=8.0)洗1次，PBS-T(含0.1%BSA，0.2%聚山梨酯20)洗1次，加鼠抗人BrdU一抗(1∶100)，37℃孵育2 h，PBS洗3次后再加FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶20)，室温孵育1 h，PBS洗3次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)，终浓度为4 μmol·L-1，和 RNAase，终浓度为2 μg·mL-1，室温孵育15 min，后放入流式细胞仪检测。

1.4 Western blot检测相关蛋白表达 PC3细胞接受相应干预24 h后，用0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗2次后，用适量放射免疫沉淀测定(radioimmune precipitation assay，RIPA)细胞裂解液冰上裂解30min，4℃下，12 000 r·min-1(离心机半径10 cm)离心10 min，取上清液，加等体积2×十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)上样缓冲液，混匀后置于100℃水浴5 min。蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏二氯乙烯(polyvinylidene dichloride，PVDF)膜转膜(350 mA，90 min)，5%BSA封闭非特异性结合，然后孵育一抗［兔抗人硫酸甘油醛脱氢酶(phosphoribosyl glucinamide synthetase，GAPDH)、总蛋白激酶 B(protein kinase B，又称AKT)及磷酸化AKT抗体］，4℃过夜。次日用 TBST洗3次，然后孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的抗兔IgG，室温孵育2 h后，TBST洗3次，每次15 min，最后用电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)显色。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0软件对组间进行均数t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAT-N24对前列腺癌PC3细胞DNA合成的影响对目的时间收取并固定的细胞进行BrdU掺入法染色，流式细胞仪检测细胞合成期(S期)的BrdU阳性细胞比例。结果显示:空白组(37.9±3.2)%，对照多肽组(36.2±4.1)%，TAT-N24组(21.5% ±2.4)%;TAT-N24组与空白组和对照多肽组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果提示:TAT-N24能有效抑制前列腺癌PC3细胞的DNA合成。

2.2 TAT-N24对前列腺癌PC3细胞系细胞周期的影响 上述细胞BrdU染色后，进行流式细胞仪检测，进行细胞周期分析。结果显示:空白组G0/G1期(56.9±6.1)%，S期(27.0±2.3)%，G2/M 期(16.1±1.3)%;对照多肽组G0/G1期(57.9±4.8)%，S期(24.2±3.1)%、G2/M 期(27.8±1.4)%。TAT-N24组G0/G1期(68.6±5.4)%，S期(19.4±1.5)%，G2/M 期(12.3±1.4)%.结果提示:TAT-N24能有效阻滞PC3细胞周期进程于G0/G1期。统计学分析显示TAT-N24组与其他两组G0/G1期细胞比例比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 TAT-N24对前列腺癌PC3细胞系的AKT磷酸化的影响 PI3K下游信号通路的活性主要表现为AKT的磷酸化状态，AKT磷酸化后进而促进细胞生长和存活等。细胞处理至目的时间，收集细胞提取总蛋白进行Western blot检测，观察 TAT-N24对 PC3细胞的AKT磷酸化水平的影响。应用NIH Image J软件对结果进行定量分析，组间进行均数t检验，差异无统计学意义(P＞0.05)。提示TAT-N24对PC3细胞的AKT磷酸化水平无明显影响。见图1。

3 讨论

PI3K是由催化亚基和调节亚基形成的异二聚体结构，二者结合后能够激活下游信号通路［17］。研究表明该通路在多种人类实体肿瘤中异常活化［18］。针对PI3K信号通路的抑制剂在肿瘤治疗方面取得了较大进展。但由于这些经典的PI3K抑制剂最终通过抑制AKT磷酸化水平而发挥作用，这影响了PI3K的正常生理功能，导致高血糖和免疫失衡等不良反应［18］。

P55PIK是PI3K的调节亚基之一，同其他调节亚基一样具有较为保守的结构域，除此之外，其氨基端(N端)的24个氨基酸(N24)是其区别于其他调节亚基的最重要的特征［5］。此外 XIA等［5］发现 N24能够结合并磷酸化细胞周期调节蛋白Rb，进而调控细胞周期进程。因此，在细胞内高表达N24可能影响肿瘤细胞的细胞周期进程，达到抑制肿瘤生长的目的。

图1 3组前列腺癌PC3细胞的AKT磷酸化的比较A.空白组;B.对照多肽组;C.TAT-N24组Fig．1 The comparison of AKT phosphorylation of prostate cancer cell line PC3 in three groups A.the blank group;B.the control peptide group;C.the TATN24 group

本研究显示:TAT-N24能有效抑制前列腺癌PC3细胞的DNA合成，阻滞细胞周期进程于G0/G1期。其可能的机制为:外源性N24通过竞争性结合Rb蛋白，降低了内源性p55PIK对Rb的磷酸化作用，进而影响Rb对细胞周期的调节，导致细胞周期被阻滞于G0/G1期，同时抑制细胞的DNA合成。此外，结果提示TATN24未影响PI3K经典通路下游AKT的磷酸化水平，在减少不良反应方面，这可能比经典的PI3K/AKT抑制药更具优势，但此点有待动物实验进一步证实。TAT-N24作为特异性抑制p55PIK信号转导的分子靶向药物，具有较好应用前景。

［1］ VIVANCO I，SAWYERSC L.The phosphatidylinositol-3-kinase AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(7):489-501.

［2］ WILLIAM G K Jr.Functions of the retinoblastoma protein［J］.Bioessays，1999，21(11):950-958.

［3］ VANHAESEBROECK B，LEEVERS S J，PANAYOTOU G，et al.Phosphoinositide 3-kinases:a conserved family of signal transducers［J］.Trends Biochem Sci，1997，22(7):267-272.

［4］ 高霞，龙浩成，刘双又，等.信号传导途径p55P13K-Rb在胃肠道肿瘤中的表达及意义［J］.华中科技大学学报:医学版，2006，35(6):761-763.

［5］ XIA X ，CHENG A ，AKINMADE D，et a1.The N-terminal 24 amino acids of the p55 gamma regulluatory subunit of phosphoinositide-3-kinase binds Rb and induces cell cycle arrest［J］.Mol Cell Biol，2003，23(5):1717-1725.

［6］ HU J，XIA X，CHENG A ，et al.A peptide inhibitor derived from p55PIK phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit:a novel cancer therapy［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(12):3719-3728.

［7］ 孙黎，袁响林，王桂华，等.磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基N末端24个氨基酸对肝癌细胞增殖的抑制［J］.华中科技大学学报:医学版，2009，38(4):430-432，437.

［8］ 王桂华，胡俊波，龚建平，等.磷脂酰肌醇-3激酶N末端的24个氨基酸抑制结肠癌细胞增殖的作用［J］.癌症，2007，27(10):1034-1038.

［9］ 刘双又，王晶，胡俊波，等.磷脂酰肌醇3-激酶上的一段多肽对Jurkat细胞的周期阻滞作用［J］.中华血液学杂志，2005，26(12):758-759.

［10］ 王晶，刘双又，胡俊波，等.N24p55γPl3K靶向抑制胃癌细胞增殖的研究［J］.中华实验外科杂志，2006，23(10):1221-1223.

［11］ HU J B，LIU S，WANG J，et al.Overexpression of the N-terminal end of the p55γ regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-kinase blocks cell cycle progression in gastric carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2005，26(5):1321-1327.

［12］ 王桂华，邓豫，李小兰，等.TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定［J］.华中科技大学学报:医学版，2010，39(2):175-178.

［13］ 吕峰，王桂华，邓豫，等.穿膜融合多肽TAT-N24对S180腹水瘤生长的抑制作用［J］.华中科技大学学报:医学版，2010，39(3):369-371，380.

［14］ 王桂华，邓豫，杨锐，等.穿膜融合多肽TAT-N24对结肠癌细胞增殖的影响［J］.肿瘤防治研究，2010，37(7):766-768.

［15］ 吴阶平，顾方六，郭应碌，等.吴阶平泌尿外科学［M］.济南:山东科学技术出版社，2005:965-980.

［16］ 潘玉琢，李扬，赵雪俭，等.STEAPl在人前列腺组织中的表达与分布［J］.吉林大学学报:医学版，2005，31(6):843-845.

［17］ ENGELMAN JA，LUO J，CANTLEY LC.The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth and metabolism ［J］.Nat Rev Genet，2006，7(8):606-619.

［18］ YUAN T L，CANTLEY L C.PI3K pathway alterations in cancer:variations on a theme ［J］.Oncogene，2008，27(41):5497-5510.