银耳多糖的抗肿瘤作用及其机制*

韩英，徐文清，杨福军，沈秀，洪阁，黄洁，周则卫

(中国医学科学院放射医学研究所，天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

银耳(Tremella fuciformis Berk)又称白木耳，为常用保健品，其主要化学成分为银耳多糖［1-2］。大量实验研究表明，银耳多糖具有抗辐射［3］、抗氧化［4］、增强免疫力［5］、升高白细胞、降血糖以及抗肿瘤等作用［6］。研究表明，药物抗肿瘤作用的机制与增强免疫和诱导凋亡等有关［7］。为了进一步开发银耳多糖的药用价值，研究其抗肿瘤作用的机制，笔者从银耳孢子发醇粉中提取、分离得到了一种均一体银耳孢子多糖，观察其对小鼠H22肝癌的抑制作用，用基因芯片技术初步探讨银耳多糖抑制肝癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 银耳多糖(相对分子质量为68 000，中国医学科学院放射医学研究所药物室从银耳孢子发酵粉中提取、分离得到的均一体多糖)，香菇多糖(福州梅峰制药厂，批号:041201)，氟尿嘧啶(南通海尔斯药业有限公司，批号:20040301)，顺铂(云南生物谷灯盏花药业有限公司，批号:20040701)，H22肝癌细胞株(天津市医药科学研究所)。昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄兼用，军事医学科学院动物室，许可证号:SCXK-(军)2002-001。芯片类型:BiostarM-40s，上海联合基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷H22肝癌小鼠模型的建立 100只实验小鼠，每只左腋窝皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL，活细胞数为1×106。

1.2.2 分组与给药 接种后随机分为药物组和对照组，药物组分高、中、低3个剂量组，于接种后第2天分别腹腔注射银耳多糖12，6和1 mg·kg-1，间隔2 d给药1次，共给药3次，阳性药(顺铂、香菇多糖)采用相同给药方式，对照组只给予0.9%氯化钠溶液。为了比较给药方式对肿瘤的抑制作用，设银耳多糖连续给药组(给药10次)。基因芯片实验用肿瘤组织，每组选取6 mg·kg-1作为样本。

1.2.3 疗效评价 停药24 h处死小鼠，称定体质量，解剖，剥离瘤块，称瘤质量。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤重×100%。基因芯片实验用肿瘤组织放置在液氮罐中保存。

1.2.4 总RNA的提取及纯化 取冻存的实验组(15只)和对照组(15只)肿瘤组织，按组别用组织匀浆机分别混匀，用UNIzol试剂抽提肿瘤组织的总RNA，紫外分析及电泳检测。用OligotexmRNA Midi试剂盒纯化mRNA。

1.2.5 探针标记 逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记实验组和对照组肿瘤组织的mRNA，经乙醇沉淀后溶解在杂交液中。

1.2.6 芯片杂交与荧光扫描 将基因芯片和杂交探针置于95℃水浴中变性2 min;将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18 h)。然后去除盖玻片，洗涤、晾干。用Scan Array 4000扫描仪扫描芯片，Gene Pix Pro 3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，基因差异表达标准:Cy5和Cy3的比值＜0.5为表达下调，0.5～2.0表示差异无统计学意义，＞2.0表达上调。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件进行，多组间比较用One-Way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银耳多糖抑制小鼠H22肝癌实验 顺铂对小鼠H22肝癌具有明显的抑制作用。香菇多糖和银耳多糖对H22肝癌均具有一定的抑制作用，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。但顺铂影响小鼠的生长，使其体质量减轻。相反，香菇多糖和银耳多糖可促进小鼠体质量增加，与对照组比较，体质量增加明显。见表1。银耳多糖对荷H22肝癌小鼠肝、脾、胸腺指数的影响见表2。结果表明，顺铂可明显伤及小鼠的肝、脾、胸腺等器官，使其萎缩。相反，香菇多糖和银耳多糖可促使小鼠肝、脾、胸腺等器官有一定程度的增长。因为脾、胸腺为免疫器官，因此可见，香菇多糖和银耳多糖可促进小鼠免疫功能的增强。

2.2 总RNA电泳分析 抽提出的样品和对照的总RNA通过电泳，进行纯度分析。结果如图1。结果表明，RNA样本的A260/A280的比值为1.9～2.0，总RNA电泳图谱有清晰的28S，18S条带证明抽提得到高纯化的总RNA，可以用于基因芯片研究。

2.3 芯片检测结果 本实验结果经Scan Array 4000扫描仪扫描，用BiostarM-40s图像处理软件:Gene Pix Pro 3.0处理扫描结果，用Cy5/Cy3信号比值判定结果。结果见图2。图中，X轴、Y轴分别以Cy3和Cy5荧光强度值(前景值-背景值)和荧度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号;数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0，基本属非差异表达;数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值＜0.5或＞2.0，该点很可能属于表达差异。分析结果表明，共有324数据点为黄色，表明有324个基因有表达差异。其中表达上调基因185个，表达下调基因139个。因为差异表达基因数量太多，不再具体列出基因编号和强度比值。

3 讨论

在抑制H22肝癌实验中，连续给药组抑制肿瘤效果不如间隔给药组，原因可能是银耳多糖作为免疫调节剂发挥抗肿瘤作用，连续给药会造成免疫麻痹，从而使抑瘤效果降低。

表1 7组小鼠H22肝癌抑制实验结果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

表1 7组小鼠H22肝癌抑制实验结果Tab．1 The inhibition effect of H22 hepatoma ofm ice in seven groups ±s

与对照组比较，*1 P＜0.01，*2 P＜0.05Compared with control group，*1 P ＜0.01，*2 P ＜0.05

组别 剂量/(mg·kg-1)小鼠/只给药次数/次体质量增长 瘤质量g抑瘤率/%银耳多糖低剂量组 1 10 3 6.82±2.33*1 1.66±1.09*1 59.0中剂量组 6 10 3 7.20±1.52*1 1.12±0.76*1 72.3高剂量组 12 10 3 6.27±1.93*2 1.77±1.04*1 56.3连续给药组 12 10 10 5.51±3.04 2.18±1.41*1 46.2香菇多糖组 1 10 3 7.93±2.55*1 1.50±1.17*1 63.0顺铂组 5.3 10 3 -4.49±1.75*1 0.93±0.15*1 90.4对照组 … 10 … 3.20±3.18 4.05±1.27…

表2 7组荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指数比较Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

表2 7组荷瘤小鼠肝、脾、胸腺指数比较Tab．2 The comparisons of liver，spleen and thymus index of tunor-bearingm ice in seven groups mg·g-1，±s

与对照组比较，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

组别 剂量/(mg·kg-1)小鼠/只给药次数/次肝指数 脾指数 胸腺指数银耳多糖低剂量组 1 10 3 25.2±4.0 15.74±3.62 4.08±0.99*1中剂量组 6 10 3 24.3±4.7 14.89±3.41 4.55±0.97高剂量组 12 10 3 22.5±3.4 16.06±4.08 4.84±1.11*1连续给药组 12 10 10 23.3±2.6 17.31±2.88 4.44±1.48香菇多糖组 1 10 3 24.7±2.8 16.32±3.17 3.04±0.58顺铂组 5.3 10 3 9.8±1.9*2 3.36±1.34*2 1.65±0.54*2对照组 … 10 …22.7±6.3 13.44±4.60 3.61±0.91

不同组织样本(对照组/实验组)杂交信号强度散点图，只是一个示意图，表明在基因芯片上表达差异基因与非差异表达基因的数量，具体基因的变化在图1中表现不出来。通过追踪文献以及与功能基因芯片信息的比对分析，可以将这些表达差异基因分为以下几个方面。①信号转导基因，如:钙信号分子基因，信号转导蛋白基因，JAK-STAT通路基因，应激/热休克通路基因等。②干细胞和分化细胞的分子标志基因，如:GOLLI-MBP/HMBPR， LC1/MAP5， Tubb3， Actc1，GREMLIN2/PRDC。③细胞因子、转录因子基因，如:DISM2/PPP1C，GABPA。④细胞基质和细胞粘连相关基因，如:COL3A-1/MMS10-W，DC/DSPG2。⑤转运和泵基因，如:SUR2/SUR2A，ANT2，ATP5B。⑥乳腺癌直接相关基因，如:RAC2，24P3/NGAL。⑦p53上游信号/p53调节剂基因，p53信号通路基因，如:CSNK1A，BETA/REV-ERB。⑧DNA损伤检测/p53和ATM通路基因，如:TI-225，ABL/C-ABL。⑨抗原递呈基因，如:CD1A/CD1D。⑩化疗应答相关基因，如:9630030H21。○11 G1 期基因，如:Rbl2，CRK3。

在用基因表达芯片研究银耳多糖抑制肿瘤作用的机制中，发现324个表达差异基因，在这些表达差异的上调/下调基因中，许多是与银耳多糖增强免疫和抗肿瘤作用相一致的。如抗原呈递基因(如CD1A/CD1D)表达上调，可以增强免疫系统对肿瘤的杀伤作用。化疗应答相关基因(如9630030H21)表达上调，可以增强肿瘤组织对化疗药物的敏感性，提高化疗药物对肿瘤杀伤作用。DNA损伤检测/p53和ATM通路基因(如TI-225、ABL/C-ABL)和G1期基因(如Rbl2、CRK3)均表达上调，具有异曲同工的作用。p53蛋白在细胞生长调节中具有重要作用，特别是在G1期调控点中的调节作用，它能抑制细胞生长，使被抑制细胞停留在G1期。研究表明，p53阻抑细胞于G1期，可能与影响相关的基因转录和DNA修复事件有关［8］。当细胞内存在DNA损伤时，有两个检查点控制细胞周期进程。其中，G1/S期及S期的检查点阻止损伤了的DNA进入S期进行复制，这样就避免新合成的DNA将损伤固定下来，防止损伤的DNA进行复制。终止DNA复制，细胞被停滞在G1期，这样就能够有足够的时间使损伤的DNA得以完成修复，从而避免错误信息的转录，控制基因突变过程，保证遗传性能的稳定性。如果DNA损伤不能得到有效修复，则p53也可诱导编程性细胞死亡［9］。

银耳多糖体内抑制肿瘤作用也是其进入体液后，作用于体内一系列的调控系统，调节相关基因的表达，发挥其肿瘤抑制效应的结果。表达谱基因芯片是用于基因组功能研究的一种应用型芯片，在功能基因组学研究中发挥广泛的作用［10］。本研究采用基因芯片分析手段，具有高通量和快速等优点。筛选得到了大量与肿瘤发生、发展和理化治疗相关的差异表达基因。通过对这些差异基因的进一步研究，有希望找到银耳多糖治疗肿瘤的新的药物作用靶点，同时，还可以发现银耳多糖其他作用靶点，拓展其临床应用范围，以期发挥更大的经济和社会效益。

［1］ 徐文清，高文远，王雪姣，等.银耳孢子多糖TFA结构的研究［J］.中草药，2008，39(8):1140-1142.

［2］ 徐文清，王雪姣，黄洁，等.银耳碱提孢子多糖A-BTF的分离及结构分析［J］.天然产物研究与开发，2007，19(6):1055-1058.

［3］ 徐文清，沈秀，周则卫，等.银耳多糖对放射和化学损伤小鼠造血功能的保护作用［J］.中草药，2006，37(7):1057-1058.

［4］ 沈卫，曲丹，蔡东联，等.银耳多糖对半乳糖所致衰老小鼠抗氧化能力的影响［J］.中华临床营养杂志，2009，17(3):158-160.

［5］ 侯建明，王爱东，雷清新，等.银耳多糖对免疫功能影响的实验报告［J］.中国疗养医学，2007，16(11):641-643.

［6］ 陈飞飞，蔡东联.银耳多糖的主要生物学效用研究进展［J］.中西医结合学报，2008，6(8):862-866.

［7］ 李璐，毕富勇，吕俊.银耳多糖诱导肝癌HepG-2细胞凋亡的研究［J］.实用医学杂志，2009，25(7):1033-1035.

［8］ 汪堃仁，薛绍白，柳惠图.细胞生物学［M］.北京:北京师范大学出版社，2000:501-508.

［9］ 夏寿萱.放射生物学［M］.北京:军事医学科学出版社，1998:245-248.

［10］ 徐伟文，李文全，毛裕民.表达谱基因芯片［J］.生物化学与生物物理进展，2001，28(6):822-826.