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3-氨基苯甲酰胺联合顺铂抑制骨肉瘤细胞生长的作用

2011-12-08郑亚东徐西强彭飞虞冀哲吴华

医药导报 2011年7期
关键词:细胞周期存活率阴性

郑亚东,徐西强,彭飞,虞冀哲,吴华

(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,武汉 430030)

骨肉瘤是儿童及青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤,其恶性程度、致残率、致死率高。20世纪70年代以前,对骨肉瘤患者进行包括截肢在内的局部治疗,总体生存率10% ~20%。随着化学治疗(化疗)水平逐渐提高,骨肉瘤患者的长期生存率得到明显改善,对于原发无转移的患者,约70%患者可以获得长期生存[1]。顺铂是骨肉瘤化疗方案中的一线药物,在临床上广泛使用。但是近来化疗耐药及对化疗不敏感的患者越来越多,骨肉瘤的疗效也停滞不前。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]是一类存在于所有哺乳动物细胞及大部分真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶,其参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式,PARP-1在DNA修复和细胞凋亡中发挥至关重要的作用[2]。3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)是一种有效的PARP-1抑制药,笔者在本研究拟探讨3-AB联合顺铂对人类骨肉瘤细胞U2OS生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 骨肉瘤细胞U2OS购于武汉博士德生物工程有限公司,3-AB为Enzo生物化学公司产品,Cell count kit-8为碧云天公司产品,碘化丙啶(propidium iodide,PI),RNase 购于 Sigma 公司,McCoy's 5 α Medium Modified培养基购于Sigma公司,胎牛血清购于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞U2OS细胞用含10%胎牛血清的McCoy's 5αMedium Modified培养基培养,每3 d换液1次,待细胞铺满瓶底 >80%时,0.25%胰酶消化,按1∶3的比例传代。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖 将U2OS细胞按每孔3 000个的密度种于96孔板,接种两块板,为单纯顺铂处理板和顺铂联合3-AB处理板,单纯顺铂处理板分为7组,分别为①组:空白组,不加细胞,②组:阴性对照组,细胞加完全培养基,③~⑦组:细胞培养基中分别加入0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 μg·mL-1顺铂溶液。顺铂联合3-AB处理板同样分为7组,①②组同前,而分别在上述③~⑦组中再加入15 mmol·L-13-AB,以上所有组均设5个复孔,刺激48 h,然后按照CCK-8说明书操作,酶标仪450 nm波长测定吸光度(A值)。设阴性对照组细胞存活率为100%,按照如下公式计算细胞存活率:存活率(%)=(加药组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期 将U2OS细胞按每皿5×104个密度种于直径6 cm的培养皿中,接种12个皿,分为4组,①组为阴性对照组,予以完全培养基培养,②组为3-AB处理组,培养基中加入10 mmol·L-13-AB,③组为顺铂处理组,培养基中加入3μg·mL-1顺铂溶液,处理6 h后换完全培养基继续培养,④组为3-AB联合顺铂处理组,培养基中加入3μg·mL-1顺铂溶液,处理6 h后换含10 mmol·L-13-AB的完全培养基继续培养,每组3皿,分别培养24,48,72 h后,收集细胞,预冷的80%乙醇固定-20℃过夜,加入PI染液及RNase,室温避光孵育30 min后流式细胞仪检测。

1.2.4 统计学方法 所有数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS11.0统计软件处理数据,采用单因素方差分析比较差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制实验 单纯顺铂处理及与3-AB阴性联合处理后细胞的存活率见图1,两组细胞的存活率均随顺铂浓度的增高而逐渐降低。不同浓度及时间3-AB对U2OS细胞的增殖活性的影响之前我们已做过研究,并筛选出刺激后细胞的存活率至少90%的最大耐受浓度及时间,即上述的15 mmol·L-13-AB刺激48 h作为与顺铂联合的浓度及时间,按照文献[3]方法,采用SPSS软件比较顺铂处理组及联合刺激组增殖抑制率达50%时的顺铂浓度,即半数抑制浓度(IC50),单纯顺铂处理 IC50为1.150 03 μg·mL-1,联合刺激组的IC50为0.652 54μg·mL-1,增敏比为1.76。

2.2 细胞凋亡检测 与阴性对照组比较,经单纯3-AB处理,及3-AB与顺铂联合处理后细胞的凋亡率均增加,而3-AB联合顺铂处理后细胞的凋亡率较单纯3-AB、顺铂处理的凋亡率为高,见图2,提示3-AB加强顺铂对U2OS细胞的促凋亡作用。

3 讨论

顺铂作为常用的化疗药物广泛应用于临床,但是存在肾毒性、严重的呕吐发应和神经毒性等不良反应,以及内在性和获得性耐药限制其应用[4]。近年许多研究者应用其他药物与顺铂联合来加强顺铂的疗效,减少其副作用和耐药性。PARP-1抑制药则是其中研究较多的一种。

1963年法国斯特拉斯堡Mandel小组发现肝细胞核中尼克酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)促进已标记的ATP合成一种难溶于酸的片段[5],后被研究者证实为聚腺苷酸二磷酸核糖,并从肝细胞核中提取一种新的酶,即PARP。PARP参与DNA修复及转录调控,被认为在细胞生存及死亡中发挥重要调控作用,并参与肿瘤发生及炎症反应过程中转录因子的调节[6]。

多项体外及体内研究证实抑制PARP-1的功能可以加强多种肿瘤细胞对顺铂的敏感性,如MIKNYOCZKI等[7]研究发现 PARP-1抑制药 CEP-6800在体外加强顺铂对Calu非小细胞型肺癌细胞的作用,并增强顺铂对荷瘤裸鼠的治疗效果;DONAWHO等[8]研究表明PARP抑制药ABT-888增强顺铂对乳腺癌裸鼠移植瘤模型的治疗效果。

本实验结果表明,PARP-1抑制药3-AB与顺铂联合较单独应用顺铂对骨肉瘤细胞U2OS抑制作用增加,增敏比为1.76,证实3-AB可以加强U2OS细胞对顺铂的敏感性;运用流式细胞术检测了联合组和单纯顺铂组的细胞凋亡率,证实联合组U2OS细胞的凋亡率高于单纯顺铂组,而细胞周期分析的结果显示3-AB与顺铂联合组较单纯顺铂组细胞周期阻滞于S期的时间更长,研究表明[9-10],当细胞遭受DNA损伤时,细胞通过一系列调节机制抑制细胞周期进行,抑制DNA复制,阻止细胞的分裂,为DNA修复系统提供时间进行DNA修复,若修复成功,细胞继续进行或完成下一个细胞周期事件,若修复不完全或不能修复,细胞则发生凋亡。笔者推测,顺铂引起骨肉瘤细胞DNA损伤,细胞周期停滞,而同时应用3-AB则抑制了DNA修复过程,导致细胞阻滞于S期的时间更长,而DNA修复受到抑制,导致凋亡增加。

综上所述,PARP-1抑制药3-AB能增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性,增强顺铂对骨肉瘤细胞的促凋亡作用,本研究结果为进一步应用PARP-1抑制药为化疗增敏剂提供了初步依据。

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