酵母双杂交系统检测 SK2与 RyR2蛋白的相互作用＊

马 晶,赵国强,朱 含,袁建党,章 茜#,安玉会

1)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州 450001 2)郑州大学基础医学院生理学教研室郑州 450001 3)郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室郑州 450001

#通讯作者,女,1957年 10月生,博士,教授,研究方向:心律失常的分子机制,E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

酵母双杂交系统检测 SK2与 RyR2蛋白的相互作用＊

马 晶1),赵国强1),朱 含2),袁建党2),章 茜2)#,安玉会3)

1)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州 450001 2)郑州大学基础医学院生理学教研室郑州 450001 3)郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室郑州 450001

#通讯作者,女,1957年 10月生,博士,教授,研究方向:心律失常的分子机制,E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

小电导 Ca2+激活 K+通道;肌浆网;酵母双杂交;相互作用

目的:探讨小电导 Ca2+激活 K+(SK)通道亚型 SK2通道与肌浆网 (RyR)2蛋白的相互作用。方法:经PCR扩增及酶切鉴定,构建含有 SK2和 RyR2目的基因片段的酵母表达载体 pGBKT7-SK2和 pGADT7-RyR2。pGBKT7-SK2与 pGADT7-RyR2经电转化法转化酵母宿主 AH109,X-α-Gal/3AT/SD/-Trp-Leu培养鉴定阳性克隆。结果:获得 3个重组质粒 pGBKT7-SK2和 16个重组子 pGADT7-RyR2。酵母双杂交检测结果显示 pGBKT7-SK2与pGADT7-RyR2可转化酵母AH109,但无阳性菌落生长。结论:SK2和 RyR2蛋白之间可能无直接相互作用。

小电导 Ca2+激活 K+(small-conductance calcium-activated potassium channel,SK)通道有 4种不同的亚型,分别为 SK1、SK2、SK3和 SK4通道[1]。人和小鼠的心肌组织存在 SK2通道,参与心肌细胞动作电位 (action potential,AP)复极化的构成[2-3]。SK通道是依赖于细胞内 Ca2+激活的 K+通道,其钙源主要来自细胞膜 L-Ca2+通道,部分可能与肌浆网(ryanodine receptor,RyR),即 Ca2+释放通道有关[4]。作者之前的工作首次验证了心肌 SK2通道与 RyR2(心脏 RyR型受体)为一功能复合体,具有相互作用[3]。为进一步探讨 SK2的功能,作者采用酵母双杂交系统检测了 SK2蛋白与 RyR2蛋白之间是否存在直接相互作用,报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 酵母菌株 AH109、酵母表达载体pGBKT7及pGADT7、酵母培养基 YPD、缺陷型培养基 SD/-Trp-Leu和 SD/-Trp为Clontech公司产品; DH5α大肠杆菌菌株为郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室保存;含有完整的小鼠 RyR2 cDNA质粒由 Ray博士 (加拿大卡尔加里大学)惠赠;含有完整的小鼠 SK2 cDNA质粒购自OriGene Technologies公司。

1.2 工具酶与试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP和质粒小量提取试剂盒购自 Promega公司;EcoRⅠ内切酶、NdeⅠ内切酶、BamHⅠ内切酶、T4 DNA连接酶和X-α-Gal购自 TaKaRa公司;凝胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司;常规分子生物学试剂为国产分析纯或进口分装。

1.3 目的基因片段的亚克隆 使用 DNASTAR、DNASIS和VectorNTIAdvance等软件,并参考文献[5]综合分析 SK2蛋白结构域,将 SK2分为 3个片段,分别包含N-末端、C-末端和跨膜区。参阅文献[6]综合分析 RyR2蛋白结构域,将RyR2分成 16个片段。根据 GenBank SK2基因 (I D BC125475)和RyR2基因序列 (I D NM_023868)分别设计引物,由上海博兴生物公司合成。采用 PCR扩增、胶回收纯化 RyR2 16个目的基因片段和 SK2 3个目的基因片段,分别与 T载体连接,形成重组子转化DH5α,对筛选出的阳性克隆进行DNA测序分析。

1.4 线性双黏 pGBKT7和 pGADT7载体重组及鉴定[7]将3个 SK2双黏目的基因片段分别与线性双黏pGBKT7载体重组;将 16个 RyR2双黏目的基因片段分别与线性双黏 pGADT7载体重组。重组子 pGBKT7-SK2用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切鉴定, pGADT7-RyR2用EcoRⅠ、B amHⅠ/N deⅠ和B amHⅠ双酶切鉴定。

1.5 酵母感受态制备及转化 从 YPDA平板上挑取AH109单克隆,接入 YPDA液体培养基,经重悬、洗涤及离心沉淀获得感受态酵母细胞。分别将 pGBKT7-SK2和 pGADT7-RyR2电转化感受态酵母细胞AH109,涂布 X-α-Gal/SD/-Trp平板培养。蓝色菌落表明对酵母细胞有激活能力。

1.6 酵母双杂交实验 将 3个酵母表达载体 pGBKT7-SK2分别与 16个表达载体 pGADT7-RyR2进行组合,两两配对(共 48对),采用山梨醇电转化法将 48个配对分别转化入感受态酵母 AH109,点于X-α-Gal/3-AT/SD/-Trp-Leu固体培养基,30℃倒置培养3 d。同时以含有 pGBKT7-53/pGADT7-T的酵母菌AH109点种作为对照。若上述转化酵母菌落生长且变蓝,说明转化子之间有相互作用;若为白色菌落生长,说明两转化子转入核内,但无相互作用。

2 结果

2.1 酵母表达质粒 pGBKT7-SK2的构建结果 经PCR扩增,获得 3个 SK2目的基因片段,分别为411、729和 546 bp。将 3个目的基因分别克隆至 T载体,转化E.coliDH5α,筛选出的阳性克隆测序结果与 GenBank中报道的 SK2序列一致。3个重组子与 pGBKT7连接,经酶切鉴定,得到重组酵母表达载体 pGBKT7-SK2441、pGBKT7-SK2729和 pGBKT7-SK2546(图 1)。

图1 重组质粒pGBKT7-SK2双酶切图

2.2 酵母表达质粒 pGADT7-RyR2的构建结果经 PCR扩增,获得 16个 RyR2目的基因片段: 1 159、1 166、1 186、1 203、1 062、814、1 235、1 693、1 070、1 104、1 049、662、870、1 006、845和 684 bp。分别将 16个RyR2目的基因片段亚克隆至 T载体,转化E.coliDH5α,经酶切筛选阳性克隆测序,结果与 GenBank报道的 RyR2序列完全一致。将 16个重组子 RyR2-T所含的目的基因片段分别克隆到pGADT7酵母表达载体,经 PCR和酶切鉴定获得重组 质 粒:pGADT7-RyR21159、pGADT7-RyR21166、pGADT7-RyR21186、 pGADT7-RyR21203、 pGADT7-RyR21062、 pGADT7-RyR2814、 pGADT7-RyR21235、pGADT7-RyR21693、 pGADT7-RyR21070、 pGADT7-RyR21104、 pGADT7-RyR21049、 pGADT7-RyR2662、pGADT7-RyR2870、 pGADT7-RyR21006、 pGADT7-RyR2845和 pGADT7-RyR2684(图 2)。

2.3 酵母双杂交实验结果 AH109于 X-Gal缺陷型培养基上无蓝色菌落生长。pGADT7-RyR2/pGBKT7-SK2配对分别转化入酵母 AH109,48个培养组菌落均为白色,而对照菌落为蓝色,说明 SK2蛋白与RyR2蛋白之间无直接相互作用。

图2 重组质粒pGADT7-RyR2酶切鉴定

3 讨论

SK2通道是位于细胞膜上的 K+通道蛋白,通过膜电位与 Ca2+整合而参与AP的构成,影响 AP复极化末期,而此期相当于心肌细胞兴奋性的相对不应期和超常期,涉及临床心律失常发生的重要机制[8-9]。然而,对心肌 SK通道的作用机制及其相关分子,少有报道。

作者前期工作[3]表明,天然心肌组织中 SK2与RyR2之间可能具有相互作用,为进一步探讨 2者间是否存在直接相互作用,该研究以酵母双杂交系统进行了检测。作者首先采用酵母双杂交系统对 SK2与RyR2蛋白之间的相互作用进行了初步的探讨。经 PCR扩增3个 SK2和16个RyR2目的基因片段,成功构建了酵母表达质粒 pGBKT7-SK2和pGADT7-RyR2。作者所采用的酵母菌株 AH109含有 3种报告基因:Ade2、His3和Mel1(或 LacZ),研究中应用X-α-Gal来检测报告基因的激活情况。结果表明酵母表达质粒本身不具有自激活效应,故可用于该双杂交系统模型。酵母双杂交实验结果表明 SK2与RyR2蛋白之间并没有直接相互作用。酵母双杂交系统是一种在真核细胞酵母内检测蛋白与其他研究蛋白相互作用的方法,得到的结果可能与天然情况相似[10-11]。但是,该技术也存在着某些缺陷,它不能检测所有的蛋白与蛋白之间的相互作用。对于在细胞内不能正确折叠以及不能转移到核内的蛋白不能检测[12]。此外,对于那些发生在膜上的相互作用的蛋白,可能由于环境的不同而使它们不能形成正确的构象[10,12],导致在酵母细胞核中不发生相互作用,故对这类蛋白的检测也可能出现假阴性。SK2及 RyR2都属于膜蛋白,采用酵母双杂交系统检测它们是否存在直接的相互作用,尚不能完全排除上述因素的影响。因此,SK2与 RyR2之间是否具有功能上的相互作用,有待用其他技术进一步证实。

[1]Köhler M,Hirschberg B,Bond CT,et al.Small-conductance,calcium-activated potassium channels from mammalian brain[J].Science,1996,273(5282):1709

[2]Xu Y,TutejaD,Zhang Z,et al.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts[J].J Biol Chem,2003,278(49): 49085

[3]ZhangQ,TimofeyevV,Lu L,et al.Functional roles of a Ca2+-activated K+channels in atrioventricular nodes[J]. Circ Res,2008,102(4):465

[4]Yanovsky Y,ZhangW,Misgeld U.Two pathways for the activation of s mall-conductance potassium channels in neurons of substantia nigra pars reticulate[J].Neuroscience, 2005,136(4):1027

[5]LuL,ZhangQ,TimofeyevV,et al.Molecular couplingof a Ca2+-activated K+channel to L-type Ca2+channels via alpha-actinin2[J].Cir Res,2007,100(1):112

[6]George CH,Sorathia R,Bertrand BM,et al.In situmodulation of the human cardiac ryanodine receptor(hRyR2) by FKBP12.6.[J].Biochem J,2003,370(Pt 2):579

[7]ZhangQ,Yuan JD,Zhao GQ,et al.Construction and identification ofmouse SK2 gene subclones[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(28):5313

[8]LiN,TimofeyevV,Tuteja D,et al.Ablation of a Ca2+-activated K+channel(SK2 channel)results in action potential prolongation in atrialmyocytes and atrial fibrillation [J].J Physiol,2009,587(Pt 5):1087

[9]Ozgen N,DunW,Sosunov EA,et al.Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2 channels to membrane sites[J].Cardiovasc Res,2007,75(4):758

[10]Ito T,Chiba T,Ozawa R,et al.A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome[J]. Proc NatlAead SciUSA,2001,98(8):4569

[11]周丽娜,吴军,贺伟峰,等.酵母双杂交系统筛选 FOXP3的相互作用蛋白 [J].第三军医大学学报,2008,24 (30):2258

[12]Fang Y,MacoolDJ,Xue Z,et al.Developmentof a highthroughput yeast two-hybrid screening system to study protein-protein interaction in plants[J].Mol Genet Genomics,2002,267(2):142

Identification of interaction bet ween SK2 and RyR2 protein by yeast twohybrid system

MA Jing1),ZHAO Guoqiang1),ZHU Han2),YUAN Jiandang2),ZHANG Q ian2),AN Yuhui3)1)Departm ent of M icrobiology and Imm unology,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University, Zhengzhou 4500012)Depart m ent of Physiology,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500013)Departm ent of B iochem istry and M olecularB iology,College of B asic M edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

s mall-conductance calcium-activated potassium channel;ryanodine receptor;yeast two-hybrid;interaction

Ai m:To detect the interaction of s mall-conductance calcium-activated potassium channel(SK)2 with ryanodine receptor(RyR)2.Methods:The yeast expressive plasmid pGBKT7 vectors containing target fragments of SK2 gene and the pGADT7 vectorswith the fragments of RyR2 gene were individually constructed by PCR and restricted endonuclease.The recombinants of pGBKT7-SK2 and pGADT7-RyR2 were co-transfor med into yeastAH109 by electrophoration and inoculated into the X-α-Gal/3AT/SD/-Trp-Leu plate.The positive colonies in the plateswere screened by X-α-Gal color. Results:Three recombinants of pGBKT7-SK2 and sixteen recombinants of the pGADT7-RyR2 vectors were successfully constructed and transfor med into the yeast hostAH109.But no positive clonies in the plates were identified.Conclusion: The interaction of SK2 with RyR2 protein has not been detected in the yeast.

R310.21

＊国家自然科学基金资助项目 30870909

(2010-08-05收稿 责任编辑姜春霞)