杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定＊

柴玉荣,刘国红,崔柳青,刘红涛,李 杰,薛乐勋#

1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室郑州 450001 2)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001 #通讯作者,男,1944年 2月生,研究员,研究方向:肿瘤与生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定＊

柴玉荣1),刘国红1),崔柳青2),刘红涛2),李 杰2),薛乐勋2)#

1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室郑州 450001 2)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001 #通讯作者,男,1944年 2月生,研究员,研究方向:肿瘤与生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏盐藻;双向电泳;质谱;高盐

目的:对高盐和低盐培养条件下杜氏盐藻蛋白质组的双向电泳 (2-DE)图谱进行比较分析,筛选高盐诱导蛋白并鉴定。方法:提取高盐 (3.5 mol/L NaCl)和低盐 (1.5 mol/L NaCl)培养条件下杜氏盐藻的总蛋白并进行2-DE,考马斯亮蓝染色后用 I mage-Scanner扫描仪扫描,I mageMaster 5.0图像分析软件分析,并利用基质辅助激光解析电离质谱法 (MALD I-TOF)对在高盐培养条件下增强表达达到 3倍的蛋白进行鉴定。结果:2-DE图谱上共分离出 509个杜氏盐藻蛋白质斑点,主要分布在等电点 4～8和相对分子质量 20 000～97 000的范围内;高盐培养条件下有 21个蛋白增强表达达到 3倍并且通过MALD I-TOF鉴定出了其中的 12个。结论:成功获得了分辨率和重复性较好的杜氏盐藻蛋白质组 2-DE图谱,鉴定得到了 12种高盐诱导增强表达达到 3倍的蛋白。

近年来,人们对生物耐盐机制有了深入的认识,但植物的整个耐盐体系及耐盐机制仍不清楚[1-2]。杜氏盐藻 (Dunaliella salina,D.salina)是一种没有细胞壁的单细胞真核绿藻,其突出优点在于光合自养、培养条件简单且抗逆性极佳,能在NaCl浓度很高甚至饱和的环境中生长繁殖[3]。目前,以盐藻作为研究植物耐盐机制的模式生物已取得了一些成果[4-5]。王晓庆等[6]用第二向垂直电泳 (SDS-PAGE)的方法发现盐藻中相对分子质量为 51 000和 23 000的蛋白可能与其耐盐机制有关。作者采用蛋白质双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离低盐和高盐培养条件下D.salina的总蛋白,获得差异蛋白质表达谱,并对明显增强表达的蛋白斑点进行了鉴定,以期为进一步克隆鉴定特异的盐藻耐盐基因及最终阐明高等植物的耐盐机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 24 cm线性 pH 3～10固相 pH梯度 (immobilized pH gradients,IPG)胶条,Ettan IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALTsix电泳仪、I mage-Scanner图像扫描仪、I mageMaster 5.0凝胶图像分析软件及标准蛋白标志物为 GE公司产品;pH 3～10两性电解质、尿素及硫脲为Bio-Rad公司产品;3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基 ]丙磺酸盐 (CHAPS)、蛋白酶抑制剂、Triton-X 100、二硫苏糖醇 (DTT)、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、小牛血清白蛋白均为 Sigma公司产品。

1.2 D.salina细胞的培养与分组D.salina购自美国德州大学,采用改良的 PKS液体培养基[7],培养条件为:26℃,光照强度 4 500 Lux,12 h光照,12 h暗培养。分别取在高盐 (3.5 mol/L NaCl)和低盐(1.5 mol/L NaCl)条件下培养至对数生长期的盐藻细胞,经 2000 r/min离心 5 min后富集。

1.3 D.salina细胞总蛋白的提取 加入裂解缓冲液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.02 mol/L DTT、20 g/L CHAPS、体积分数 0.2%两性电解质、体积分数1%Triton-X 100及蛋白酶抑制剂)混匀后超声破碎,三氯醋酸-丙酮沉淀法过夜。蛋白沉淀后用上样缓冲液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.02 mol/L DTT、20 g/L CHAPS、体积分数 0.2%两性电解质和体积分数 0.05%IPGBuffer)复溶,采用BradFord法测定蛋白浓度。

1.4 第一向等电聚焦电泳(IEF) 用 24 cm线性pH 3～10 IPG胶条,蛋白样品上样量均为 400μg,用 IPGphor等电聚焦系统进行 IEF。程序如下:30 V,12 h;200 V,1 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;线性梯度从 1 000 V升至 8 000 V;8 000 V,10 h,限制电流为50μA/胶条。

1.5 SDS-PAGE 将聚焦后的胶条在 SDS平衡液

(1.5 mol/L Tris-Cl,pH 8.8;50 mmol/L体积分数30%甘油;6 mol/L尿素;20 g/L SDS)中平衡 2次,摇床上振荡 15 min/次,其中第 1次平衡液中加入 20 mmol/L DTT,第 2次平衡液中加入 100 mmol/L碘乙酰胺。取出胶条在 Ettan DALTsix上进行垂直 SDSPAGE,用 125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶分离,40 mA 40 min,60 mA 5 h,直至溴酚蓝前沿到达玻璃板底部。

1.6 图像分析 凝胶经考马斯亮蓝染色及脱色后,用 I mage-Scanner扫描仪扫描 2-DE图像,I mageMaster 5.0软件进行图像分析。高盐培养和低盐培养得到的 2块蛋白胶,通过蛋白斑点检测和匹配分析,选定在高盐条件下盐藻蛋白增强表达达到 3倍以上的斑点。

1.7 差异表达蛋白的鉴定 将选定的斑点从 2-DE凝胶上切下,胰蛋白酶消化后进行基质辅助激光解析电离质谱法(MALD I-TOF)分析,利用肽指纹图谱比对程序将所得质谱数据信息在NCB I植物数据库中进行比对分析,筛选出比对结果达到预期肽指纹图谱比对程度分值要求的蛋白质。

2 结果

2.1 D.salina总蛋白 2-DE考马斯亮蓝染色图谱高盐和低盐培养条件下盐藻总蛋白的 2-DE图谱(图 1)斑点清晰,重复性好,主要分布在等电点 (p I) 4～8和相对分子质量 20 000～97 000范围内。2块胶中匹配的蛋白质点为 509个,从中筛选出高盐下蛋白增强表达达到3倍的蛋白点共 21个。

2.2 高盐培养条件下增强表达蛋白的鉴定 所筛选的 21个蛋白经质谱分析和数据库比对,其中 9个蛋白未找到有效匹配结果;其余12个蛋白均获得有效匹配结果,得以鉴定,其中 2个暂未命名,余 10个鉴定结果见表 1。

图 1 高盐(A)和低盐(B)培养条件下的D.salina总蛋白的 2-DE图谱

表1 鉴定的2-DE图谱中的高盐诱导蛋白

3 讨论

近年来,蛋白质组学方法已经广泛应用于从生物整体水平分析样本间蛋白表达的差异,它具有高通量的特点[8]。2-DE技术是目前蛋白质组学研究中分离蛋白质的核心方法,利用 2-DE技术分离不同样本的总蛋白,可获得分辨率高且重复性好的 2-DE图谱,这是筛选鉴定差异表达蛋白的基础。该实验中所获得的低盐和高盐培养条件下盐藻总蛋白的2-DE图谱分辨率高,蛋白斑点清晰均匀,且重复性好,为后续的分析和鉴定提供了可靠基础。

尽管数据库中盐藻的基因组序列和蛋白质组序列非常有限,蛋白质组学分析仍然是一种非常有效的检测和鉴定盐藻中差异蛋白质表达的方法[3-4]。该研究中,尽管高盐培养条件下D.salina总蛋白 2-DE图谱中出现了一些低盐培养条件下图谱中未显现的特异蛋白斑点,但考虑到假阳性的可能性,所以只选择了高盐培养条件下增强表达并且蛋白表达量达到3倍或以上的蛋白质点作为进一步鉴定的对象。所选择的 21个蛋白点经质谱分析后有 9个未能找到有效数据匹配,但比对的结果仍然提供了可靠的部分氨基酸序列,这些氨基酸序列为进一步对这些蛋白基因进行深入研究提供了依据。

高盐胁迫适应过程是一个复杂的相互作用的网络系统,需要大量基因协同作用。该研究中所鉴定出的高盐诱导蛋白均和高盐胁迫条件下的生物个体的生理反应相关[9-10],例如铁-超氧化物歧化酶能够清除活性氧,钙依赖性蛋白激酶和 G蛋白参与了细胞膜上的信号传导,30S核糖体蛋白 S4与盐胁迫下增强光合作用有关,ATP合成酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶和乙醇脱氢酶均与能量代谢和葡萄糖代谢相关,动力蛋白 1-α重链极有可能与盐胁迫下盐藻鞭毛的运动相关。

综上所述,作者采用 2-DE成功分离和比较了D.salina低盐和高盐培养条件下的蛋白质,质谱分析所鉴定的盐诱导相关蛋白为进一步探索其耐盐机制以及利用这些盐诱导相关蛋白来改善其他物种的耐盐性提供了依据。

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Isolation and identification of high concentration salt-induced proteins fromDunaliella salina

CHA I Yurong1),L IU Guohong1),CU I L iuqing2),L IU Hongtao2),LI Jie2),XUE Lexun2)1)Departm ent of Histology and Em bryology,College of Basic M edical Sciences,Zhengzhou University, Zhengzhou 4500012)Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University, Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;two-dimensional electrophoresis;mass spectrum;high concentration salt

Ai m:To analyze the two-dimensional electrophoresis(2-DE)maps ofDunaliella salina(D.salina)under differentNa+concentration(3.5 mol/L NaCl and 1.5 mol/L NaCl)and screen differently expressed proteins between them.Methods:2-DE was taken to separate the total proteins fromD.salinatreated with high and low concentration salt. Protein patterns were analyzed and identified by I mageMaster 5.0 software and MALD I-TOF after staining and scanning. Results:A total of 509 protein spotswere found as differently expressed proteins,out of which,the expression level of 21 proteins cultured in high concentration salt condition was three times of those cultured in low concentration salt condition. Conclusion:2-DE profiles fromD.salinawith high resolution and reproducibility have been obtained and 12 up-regulated proteins in high salt concentration have been identified.

Q786

＊国家自然科学基金资助项目 30540067

(2010-01-07收稿 责任编辑徐春燕)