L-Cys与葡萄糖对酵母发酵合成谷胱甘肽的影响

郑丽雪 ，齐斌 ，梅艳珍 ，王立梅

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

L-Cys与葡萄糖对酵母发酵合成谷胱甘肽的影响

郑丽雪1，2，齐斌1，2，梅艳珍1，2，王立梅1，*

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

通过在7.5 L发酵罐中，分别以流加葡萄糖和L-半胱氨酸与流加葡萄糖协同作用2种方式研究了酵母对分批发酵生产谷胱甘肽的影响。结果表明，从第7 h开始恒速[1.5 g/（L·h）]流加葡萄糖直至发酵结束，发酵24 h后GSH产量达最大，为151.6 mg/L，比流加前提高37%。在恒速流加葡萄糖基础上，当发酵至12 h，向发酵罐中一次性添加3 mmol半胱氨酸，最终GSH产量达最大，为213.3 mg/L，比分批发酵提高了93%。

谷胱甘肽；分批发酵；流加葡萄糖；半胱氨酸

还原型谷胱甘肽（简称GSH）是生物体内重要的生物活性物质[1]，广泛存在于动、植物及微生物细胞内。GSH作为一种抗氧化剂，能够消除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境，在医药、保健品、功能性食品、化妆品等方面具有广泛的应用前景[2]。

GSH的生产方法主要有：（1）萃取法[3]：此方法生产步骤繁杂，总收率很低。（2）化学合成法[4]：生产成本高、反应复杂耗时、产品纯度不高，并且存在环境污染问题。（3）酶法[5]：由于需要获得相关酶系、消耗昂贵的ATP以及加入前体氨基酸，因此生产成本较高。（4）酵母发酵法[6-9]：由于此法操作简单，原料来源丰富，是目前最受欢迎方法之一，研究主要集中于菌种选育、发酵条件优化。高密度发酵生产GSH的工艺条件有待进一步深入，是研究的难点之一。

利用7.5 L发酵罐研究半胱氨酸及流加葡萄糖对酿酒酵母分批发酵生产GSH的影响，为进一步放大实验和工业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

经亚硝基胍诱变选育的酿酒酵母Y518：常熟理工学院发酵工程技术研究中心保存。

1.2 仪器

Bioflo 110型7.5 L生物发酵罐：美国新布朗什维克科学公司；CR22GII型高速冷冻离心机：日本日立公司；UV-2450型紫外分光光度计：日本岛津公司；Milli-Q advantage超纯水仪：美国Millipore公司；梅特勒-托利多XS105DU型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 培养基

1）斜面培养基：PDA培养基[10]。

2）种子培养基：10°B′e麦芽汁。

3）发酵培养基：10°B′e 麦芽汁。

1.4 麦芽汁的制作方法

麦芽汁培养基的配制参考《工业微生物实验与研究技术》[11]，进一步优化工艺，确定出最佳的工艺参数：取粉碎后的大麦芽1000 g，加入4000 mL水，在62℃水浴锅中保温糖化4 h后，用纱布过滤，除去残渣，滤液中加入2个鸡蛋清，搅拌均匀后煮沸0.5 h，过滤，115℃灭菌15 min即得10°B′e麦芽汁。

1.5 培养方法

将保存的菌种活化后，以体积分数10%的接种量接入种子培养基中，在30℃条件下，180r/min培养18h，然后按10%的接种量将种子转接到装有3 L发酵培养基的7.5 L自动生物发酵罐中，通气量1 L/min,温度30℃，180 r/min培养84 h。

1.6 测定方法

1.6.1 细胞生物量测定

取发酵液于6000 r/min离心15 min，弃上清液，菌体洗涤3次后，105℃烘干至恒重，称量。

1.6.2 残糖量的测定

DNS 法[12]。

1.6.3 GSH产量的测定[13]

发酵液离心后，洗涤除去上清液，得到湿菌体，加入40%乙醇溶液于30℃振荡抽提2 h，离心，LLOXAN法测定上清液中GSH产量。

2 结果与讨论

2.1 7.5 L发酵罐中分批培养

GSH分批发酵过程曲线如图1所示。

在GSH生物合成过程中，种子和发酵培养基选用的都是新鲜麦芽汁，从图1中可以明显看出，种子液一经接种到发酵培养基中，菌体就开始迅速生长，直接进入对数生长期，同时培养基中糖浓度也迅速下降，当发酵到24h时，糖浓度由初始的42g/L迅速下降到10g/L。另外，在整个发酵过程中，细胞生长和产物生成完全相耦联，当发酵到48 h时，生物量和GSH产量都达到最大，分别为12.9 g/L、110.5 mg/L。48 h以后，生物量和GSH产量都稍有降低，此时菌体开始自溶，发酵液中菌体浓度开始下降，同时由于GSH易被氧化分解，所以其浓度也随之小幅下降[14]。

图1 GSH分批发酵过程曲线Fig.1 Process curves of batch fermentation for GSH production

2.2 恒速流加葡萄糖分批培养

在高密度发酵过程中，流加适量的葡萄糖对于GSH产量的积累非常重要[15-16]。而补糖时间和发酵液pH值上升时间有关[17]。发酵过程中，每隔1 h记录发酵液pH，绘制出前10 h pH的变化曲线，如图2。

图2 分批培养pH曲线Fig.2 Curve of pH in batch culture

由图2可见，当发酵到第7 h时，发酵液pH值由初始的4.95降到最低，为3.88，7 h以后，pH值开始缓慢上升。根据上述pH变化情况，本研究从第7h开始恒速流加葡萄糖直至发酵结束，流加量为1.5 g/（L·h）。恒速流加葡萄糖分批发酵过程曲线如图3所示。

由图3可见，流加葡萄糖分批发酵后，生物量的变化趋势大致和分批发酵过程相同，都是在48 h时达到最大，流加前后的最大生物量分别为12.9 g/L、13.5 g/L。而GSH产量的变化和流加前不同，经流加葡萄糖后，从发酵开始直至24 h，GSH产量直线上升，24 h时达最大，为151.6 mg/L，与之前分批发酵的最大值相比，提高了37%。

2.3 半胱氨酸和恒速流加葡萄糖协同作用分批培养

图3 恒速流加时GSH分批发酵过程曲线Fig.3 Process curves of batch fermentation for GSH production under constant speed feeding rate

通常情况下，细胞内自身产生的半胱氨酸不能满足GSH合成的需要，成为GSH合成的限制性因素[18]，Catalino Alfafara等[19]研究了向发酵罐中一次性添加半胱氨酸和流加2种方法对GSH比合成速率的影响。结果表明，在6.4 h时，一次性添加3 mmol/L半胱氨酸对GSH的产量有明显的促进作用。本研究在恒速流加葡萄糖的基础上，当发酵至12 h时，向发酵罐中加入3 mmol/L半胱氨酸，补料分批发酵过程曲线如图4所示。

图4 L-半胱氨酸和恒速流加协同作用时GSH分批发酵过程曲线Fig.4 Process curves of batch fermentation for GSH production under L-cysteine and constant speed feeding rate

由图4可见，当发酵到24 h时，谷胱甘肽产量达最大，为213.3 mg/L，较只流加葡萄糖提高了41%。生物量的整体变化趋势和2.1、2.2一致，都是在48 h达最大，但12 h之后，发酵液生物量总体水平较2.1、2.2有小幅度下降，与Jae-Young Cha等[20]报道的一致。总之，流加发酵与添加L-半胱氨酸结合，较大幅度的提高了目标产物GSH的产量，但是L-半胱氨酸的添加量有待于进一步的优化，以此提高GSH产量还有较大的发展空间。

3 结论

恒速流加葡萄糖、半胱氨酸和恒速流加葡萄糖协同作用都提高了目标产物GSH的产量，并且大大缩短了发酵周期，GSH总产量分别比分批发酵提高了37%和93%。在高密度培养过程中，由于细胞的快速生长导致发酵液pH不断降低，从而大大影响菌体生长及胞内GSH的积累。因此，在补料分批发酵过程中，采用恒pH的分批发酵来提高GSH的产量将有较大的发展空间。

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Effects of L-Cysteine and Glucose Fed-Batch Fermentation of Saccharomyces Cerevisiae on Production of Glutathione

ZHENG Li-xue1，2，QI Bin1，2，MEI Yan-zhen1，2，WANG Li-mei1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu,China；2.Fermentation Engineering Technology Center，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu,China）

The effect of glucose feeding and effects of L-cysteine and glucose synergistic action on the production of glutathione were investigated in 7.5 L fer mentor respectively.When glucose was fed at 7 h under a constant rate of 1.5 g/（L·h）until the end of fermentation,the maximum GSH production reached 151.6 mg/L after 24 h,increased 37%than batch culture.Based on glucose fed-batch,after 12 h and then 3 mmol/L-cysteine was added,the maximum GSH production reached 213.3 mg/L，increased 93%than batch culture.

glutathione；fed-batch culture；glucose fed-batch；L-cysteine

江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人资助项目；苏州市科技发展计划应用基础研究项目（YJG0913）；常熟理工学院青年教师科研启动项目（QZ0914）

郑丽雪（1982—），女（汉），助理实验师，硕士，研究方向：食品生物技术。

*通信作者：王立梅（1964—），女（汉），教授，博士，研究方向：食品生物技术。

2010-08-16